Publicação
Characterization of immune-modulatory MIRNAS and their role in inflammatory skin disease
| Resumo: | A psoríase vulgares é uma doença cutânea que ocorre aproximadamente em 3% da popula-ção mundial adulta, afectando negativamente a qualidade de vida dos doentes. É uma doença crónica, resultante da activação do sistema imunitário e semelhante a outras doenças auto-imunes como a artrite reumatóide ou a esclerose múltipla. Histologicamente, a psoríase é caracterizada por um aumento da espessura da epiderme devido à hiperproliferação de queratinócitos, resultando no aparecimento de escamas e placas com diferentes tamanhos. Outra particularidade desta doença é o aumento da vascularização da derme, assim como a presença de um elevado número de células imunitárias, tais como linfócitos T e células dendríticas. Ao nível molecular, pensa-se que as manifestações clínicas e laboratoriais descritas são resultantes da desregulação da complexa rede de citocinas devido à acção combinada das células imunitárias que infiltraram a derme e dos queratinócitos presentes na epiderme. Durante a última década foram identificadas inúmeras espécies de pequenos RNA denominados small non-coding RNAs, que contribuem para a intrincada rede de vias que regulam os genes humanos. Entre estes, os microRNA (miRNA) emergiram como reguladores relevantes da tradução proteica, e actualmente acredita-se que os miRNA participam na regula-ção da maioria dos processos celulares e tecidulares. A pele não é excepção, e de momento os miRNA são intensamente estudados para determinar a sua relevância na regulação da homeostase da pele e no aparecimento de doenças cutâneas. O possível envolvimento de miRNA na patologia da psoríase foi identificado pela primeira vez em 2007, quando a equipa liderada por Sonkoly comparou os perfis de expressão de miRNA em pele psoriática e em pele normal. Entre os miRNA identificados, potencialmente associados à psoríase, o miRNA-203 foi identificado predominantemente em queratinócitos e sobre-expressado em psoríase, quando comparado com a pele normal. Recentemente, a mesma equipa científica demonstrou também que o miRNA-203 e o transcrito de um componente regulador da sinalização da resposta imunitária, o SOCS3 (supressor of cytokine signalling 3), apresentam níveis de expressão inversamente relacionados. Sabe-se ainda que a proteína SOCS3 regula negativamente a activação de um factor de transcrição – STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) – que está sobre-expressado em psoríase e implicado na rede de citocinas. Assim, a sobre-expressão do miRNA-203 em psoríase pode ter importantes implicações na patologia da doença uma vez que impossibilita a expressão de SOCS3, proteína que regula negativamente a rede de citocinas. O objectivo principal deste projecto foi descrever a interacção entre miRNA e a expressão de citocinas em pele humana. Com especial interesse no miRNA-203, o projecto procurou elucidar a função específica dos miRNA moduladores da resposta imunitária na complexa rede de interacções moleculares, levando ao desenvolvimento da doença inflamatória na pele. No começo deste projecto, procurou-se estabelecer um sistema in vitro que permitisse a identificação e análise de potenciais genes-alvo de miRNA associados à psoríase. Assim, através da utilização da proteína Renilla luciferase (R-luc), foi desenvolvido um ensaio repór-ter para a detecção de interacções directas entre o miRNA-203 e diversos elementos da resposta imunitária, através da medição de bioluminescência. Os DNA complementares (cDNA) de seis diferentes citocinas (IL12B, IL15, IL17, IL20, IL24 e TNFα) assim como os cDNA de proteínas supressoras da sinalização das citocinas (SOCS3 e SOCS6) foram fundidos ao gene codificante da R-luc, e as medidas de bioluminescência foram avaliadas quando os vectores codificantes da R-luc foram co-transfectados com um vector expressan-do o miRNA-203 em células HEK293 (Human kidney embryo cells). Dos ensaios desenvol-vidos, identificaram-se três potenciais genes-alvo do miRNA-203: IL24, SOCS6 e TNFα. Para a confirmação da interacção directa entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados foi desenvolvido um estudo bioinformático para a identificação de sequências nucleotídicas na região 3‟UTR dos genes-alvo complementares à sequência nucleotídica do miRNA-203. Uma vez identificadas as possíveis sequências nucleotídicas que permitem o estabelecimento de interacções entre o miRNA-203 e os RNA mensageiro (mRNA) dos genes-alvo, as sequências identificadas nas regiões 3‟UTR foram mutadas de forma a inibir as interacções miRNA-mRNA. Os transcritos 3‟UTR mutantes dos genes IL24, SOCS6 e TNFα foram fundidos ao gene codificante da R-luc e novos ensaios repórteres foram elaborados. Em paralelo, procedeu-se também ao desenvolvimento de uma linha celular de queratinócitos (denominada HaCaT-203), através da utilização do sistema transposão de DNA “sleeping beauty”, para expressar constitutivamente o miRNA-203. Esta nova linha celular de queratinócitos foi especialmente desenvolvida para a confirmação de potenciais genes-alvo do miRNA-203, através da quantificação dos níveis de expressão dos genes-alvo por qRT-PCR. A quantifi-cação e a análise dos valores de bioluminiscência obtidos a partir da expressão do gene da R-luc fundido aos transcritos dos três 3‟UTR mutantes de IL24, SOCS6 e TNFα identificaram a interacção directa entre os três mRNA e o miRNA-203. Resultados semelhantes foram obtidos através da quantificação dos níveis endógenos dos mRNA de IL24, SOCS6 e TNFα em queratinócitos, confirmando a especificidade da interacção entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados. A identificação destes novos genes-alvo veio contribuir para a compreensão e caracterização das implicações do miRNA-203 na expressão de citocinas em pele humana. Não menos importante, também foi o facto de que os resultados obtidos vieram consolidar a hipótese de que o miRNA-203 poderá ter implicações na patologia da psoríase uma vez que o miRNA-203 foi identificado como um modulador activo na complexa regulação da rede de citocinas em queratinócitos. A equipa com a qual foi desenvolvido este projecto documentou anteriormente a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a inibição dos mRNA de TNFα e IL12B através da “entrega” (delivery) de RNA efectores anti-TNFα e anti-IL12B, respectivamente, em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes (xenografted psoriatic skin). No projecto actual, foi desenvolvido um novo vector lentiviral codificando um inibidor de miRNA específico para o miRNA-203 (denominado antagomiR-203). Os RNA efectores anti-miRNA (antagomirs) são caracterizados por sequências oligonucleotídicas complementares aos miRNA de interesse. Assim, os antagomir estabelecem interacções específicas com o miRNA-alvo, conduzindo à inibição funcional dos mesmos. Através da utilização do vector lentiviral codificando o antagomiR-203, vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para testar a funcionalidade e a potência do antagomiR-203. Com base nas avaliações funcionais, identificou-se uma nítida sobre-expressão do gene da R-luc quando fundido com uma sequência oligonucleotídica complementar ao miRNA-203, quando co-expresso com o vector lentiviral codificando o antagomiR-203. Foi também identificada uma redução dos níveis de expressão do miRNA-203, quando as linhas celulares de queratinócitos foram infectadas com partículas lentivirais expressando o antagomiR-203. Os resultados obtidos confirmaram assim a funcionalidade e especificidade do antagomiR-203 relativamente ao miRNA-203, permitindo o estabelecimento de uma nova plataforma para a regulação de miRNA através da utilização de lentivirus como veículo de transporte de anti-miRNA. Com base na tecnologia de expressão de antagomir, este projecto procurou ainda abrir caminho para os estudos de gene-alvos endógenos, permitindo experimentalmente estudar a função de miRNA em queratinócitos em pele normal e pele psoriática. Como objectivo final deste projecto, testou-se a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a “entrega” de RNA efectores anti-miRNA-203 em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes. A administração intradérmica de uma única dose de partículas lentivirais em pele psoriática humana resultou num aumento dos níveis de expressão do miRNA-203 e na não alteração da espessura da epiderme em enxertos de pele tratados com o antagomiR-203. Em conformidade com os resultados obtidos, a avaliação clínica do fenótipo psoriático dos enxertos de pele não identificou nenhuma melhoria clínica e histológica do fenótipo psoriático no ensaio desenvolvido. O potencial para a concepção de medicamentos moleculares baseados na modulação de miRNA endógenos é muito ambicionado, mas actualmente está ainda muito inexplorado. Os estudos desenvolvidos ao longo deste projecto demonstraram que o aumento da expressão do miRNA-203 na patologia da psoríase é complexo, claramente evidenciando a necessidade de estudos futuros para uma melhor compreensão das funções desempenhadas pelos miRNA na regulação da resposta imunitária. O projecto realizado procurou também explorar a aplicabilidade terapêutica de fármacos dirigidos aos miRNA, tendo-se identificado algumas dificuldades relacionadas com a funcionalidade dos antagomirs in vivo. No entanto, é de salientar que a abordagem utilizada neste estudo foi única, na medida em que se procurou explorar uma nova metodologia de administração de antagomirs, permitindo a entrega de material genético em tecidos específicos, de modo a aumentar a segurança na utilização de terapia genética em humanos. |
|---|---|
| Autores principais: | Primo, Maria do Nascimento Lopes, 1988- |
| Assunto: | Psoríase Sistema imunitário Doenças auto-imunes Expressão génica Teses de mestrado - 2011 |
| Ano: | 2011 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | A psoríase vulgares é uma doença cutânea que ocorre aproximadamente em 3% da popula-ção mundial adulta, afectando negativamente a qualidade de vida dos doentes. É uma doença crónica, resultante da activação do sistema imunitário e semelhante a outras doenças auto-imunes como a artrite reumatóide ou a esclerose múltipla. Histologicamente, a psoríase é caracterizada por um aumento da espessura da epiderme devido à hiperproliferação de queratinócitos, resultando no aparecimento de escamas e placas com diferentes tamanhos. Outra particularidade desta doença é o aumento da vascularização da derme, assim como a presença de um elevado número de células imunitárias, tais como linfócitos T e células dendríticas. Ao nível molecular, pensa-se que as manifestações clínicas e laboratoriais descritas são resultantes da desregulação da complexa rede de citocinas devido à acção combinada das células imunitárias que infiltraram a derme e dos queratinócitos presentes na epiderme. Durante a última década foram identificadas inúmeras espécies de pequenos RNA denominados small non-coding RNAs, que contribuem para a intrincada rede de vias que regulam os genes humanos. Entre estes, os microRNA (miRNA) emergiram como reguladores relevantes da tradução proteica, e actualmente acredita-se que os miRNA participam na regula-ção da maioria dos processos celulares e tecidulares. A pele não é excepção, e de momento os miRNA são intensamente estudados para determinar a sua relevância na regulação da homeostase da pele e no aparecimento de doenças cutâneas. O possível envolvimento de miRNA na patologia da psoríase foi identificado pela primeira vez em 2007, quando a equipa liderada por Sonkoly comparou os perfis de expressão de miRNA em pele psoriática e em pele normal. Entre os miRNA identificados, potencialmente associados à psoríase, o miRNA-203 foi identificado predominantemente em queratinócitos e sobre-expressado em psoríase, quando comparado com a pele normal. Recentemente, a mesma equipa científica demonstrou também que o miRNA-203 e o transcrito de um componente regulador da sinalização da resposta imunitária, o SOCS3 (supressor of cytokine signalling 3), apresentam níveis de expressão inversamente relacionados. Sabe-se ainda que a proteína SOCS3 regula negativamente a activação de um factor de transcrição – STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) – que está sobre-expressado em psoríase e implicado na rede de citocinas. Assim, a sobre-expressão do miRNA-203 em psoríase pode ter importantes implicações na patologia da doença uma vez que impossibilita a expressão de SOCS3, proteína que regula negativamente a rede de citocinas. O objectivo principal deste projecto foi descrever a interacção entre miRNA e a expressão de citocinas em pele humana. Com especial interesse no miRNA-203, o projecto procurou elucidar a função específica dos miRNA moduladores da resposta imunitária na complexa rede de interacções moleculares, levando ao desenvolvimento da doença inflamatória na pele. No começo deste projecto, procurou-se estabelecer um sistema in vitro que permitisse a identificação e análise de potenciais genes-alvo de miRNA associados à psoríase. Assim, através da utilização da proteína Renilla luciferase (R-luc), foi desenvolvido um ensaio repór-ter para a detecção de interacções directas entre o miRNA-203 e diversos elementos da resposta imunitária, através da medição de bioluminescência. Os DNA complementares (cDNA) de seis diferentes citocinas (IL12B, IL15, IL17, IL20, IL24 e TNFα) assim como os cDNA de proteínas supressoras da sinalização das citocinas (SOCS3 e SOCS6) foram fundidos ao gene codificante da R-luc, e as medidas de bioluminescência foram avaliadas quando os vectores codificantes da R-luc foram co-transfectados com um vector expressan-do o miRNA-203 em células HEK293 (Human kidney embryo cells). Dos ensaios desenvol-vidos, identificaram-se três potenciais genes-alvo do miRNA-203: IL24, SOCS6 e TNFα. Para a confirmação da interacção directa entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados foi desenvolvido um estudo bioinformático para a identificação de sequências nucleotídicas na região 3‟UTR dos genes-alvo complementares à sequência nucleotídica do miRNA-203. Uma vez identificadas as possíveis sequências nucleotídicas que permitem o estabelecimento de interacções entre o miRNA-203 e os RNA mensageiro (mRNA) dos genes-alvo, as sequências identificadas nas regiões 3‟UTR foram mutadas de forma a inibir as interacções miRNA-mRNA. Os transcritos 3‟UTR mutantes dos genes IL24, SOCS6 e TNFα foram fundidos ao gene codificante da R-luc e novos ensaios repórteres foram elaborados. Em paralelo, procedeu-se também ao desenvolvimento de uma linha celular de queratinócitos (denominada HaCaT-203), através da utilização do sistema transposão de DNA “sleeping beauty”, para expressar constitutivamente o miRNA-203. Esta nova linha celular de queratinócitos foi especialmente desenvolvida para a confirmação de potenciais genes-alvo do miRNA-203, através da quantificação dos níveis de expressão dos genes-alvo por qRT-PCR. A quantifi-cação e a análise dos valores de bioluminiscência obtidos a partir da expressão do gene da R-luc fundido aos transcritos dos três 3‟UTR mutantes de IL24, SOCS6 e TNFα identificaram a interacção directa entre os três mRNA e o miRNA-203. Resultados semelhantes foram obtidos através da quantificação dos níveis endógenos dos mRNA de IL24, SOCS6 e TNFα em queratinócitos, confirmando a especificidade da interacção entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados. A identificação destes novos genes-alvo veio contribuir para a compreensão e caracterização das implicações do miRNA-203 na expressão de citocinas em pele humana. Não menos importante, também foi o facto de que os resultados obtidos vieram consolidar a hipótese de que o miRNA-203 poderá ter implicações na patologia da psoríase uma vez que o miRNA-203 foi identificado como um modulador activo na complexa regulação da rede de citocinas em queratinócitos. A equipa com a qual foi desenvolvido este projecto documentou anteriormente a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a inibição dos mRNA de TNFα e IL12B através da “entrega” (delivery) de RNA efectores anti-TNFα e anti-IL12B, respectivamente, em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes (xenografted psoriatic skin). No projecto actual, foi desenvolvido um novo vector lentiviral codificando um inibidor de miRNA específico para o miRNA-203 (denominado antagomiR-203). Os RNA efectores anti-miRNA (antagomirs) são caracterizados por sequências oligonucleotídicas complementares aos miRNA de interesse. Assim, os antagomir estabelecem interacções específicas com o miRNA-alvo, conduzindo à inibição funcional dos mesmos. Através da utilização do vector lentiviral codificando o antagomiR-203, vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para testar a funcionalidade e a potência do antagomiR-203. Com base nas avaliações funcionais, identificou-se uma nítida sobre-expressão do gene da R-luc quando fundido com uma sequência oligonucleotídica complementar ao miRNA-203, quando co-expresso com o vector lentiviral codificando o antagomiR-203. Foi também identificada uma redução dos níveis de expressão do miRNA-203, quando as linhas celulares de queratinócitos foram infectadas com partículas lentivirais expressando o antagomiR-203. Os resultados obtidos confirmaram assim a funcionalidade e especificidade do antagomiR-203 relativamente ao miRNA-203, permitindo o estabelecimento de uma nova plataforma para a regulação de miRNA através da utilização de lentivirus como veículo de transporte de anti-miRNA. Com base na tecnologia de expressão de antagomir, este projecto procurou ainda abrir caminho para os estudos de gene-alvos endógenos, permitindo experimentalmente estudar a função de miRNA em queratinócitos em pele normal e pele psoriática. Como objectivo final deste projecto, testou-se a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a “entrega” de RNA efectores anti-miRNA-203 em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes. A administração intradérmica de uma única dose de partículas lentivirais em pele psoriática humana resultou num aumento dos níveis de expressão do miRNA-203 e na não alteração da espessura da epiderme em enxertos de pele tratados com o antagomiR-203. Em conformidade com os resultados obtidos, a avaliação clínica do fenótipo psoriático dos enxertos de pele não identificou nenhuma melhoria clínica e histológica do fenótipo psoriático no ensaio desenvolvido. O potencial para a concepção de medicamentos moleculares baseados na modulação de miRNA endógenos é muito ambicionado, mas actualmente está ainda muito inexplorado. Os estudos desenvolvidos ao longo deste projecto demonstraram que o aumento da expressão do miRNA-203 na patologia da psoríase é complexo, claramente evidenciando a necessidade de estudos futuros para uma melhor compreensão das funções desempenhadas pelos miRNA na regulação da resposta imunitária. O projecto realizado procurou também explorar a aplicabilidade terapêutica de fármacos dirigidos aos miRNA, tendo-se identificado algumas dificuldades relacionadas com a funcionalidade dos antagomirs in vivo. No entanto, é de salientar que a abordagem utilizada neste estudo foi única, na medida em que se procurou explorar uma nova metodologia de administração de antagomirs, permitindo a entrega de material genético em tecidos específicos, de modo a aumentar a segurança na utilização de terapia genética em humanos. |
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