Publicação

Evaluation of immunoproteasome inhibition in the differentiation and maturation of dendritic cells

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Muitos processos fisiológicos e patológicos dependem do funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). Este sistema é responsável pela degradação da maior parte das proteínas nas células eucarióticas. As proteínas são biomoléculas de nitrogénio de elevadas dimensões formadas por resíduos de aminoácidos e que possuem funções complexas que permitem o bom funcionamento do organismo. Deste modo, torna-se essencial manter a integridade celular das proteínas dentro de valores aceitáveis para garantir o seu correto funcionamento. Da incorreta conformação e agregação das proteínas podem surgir diversas doenças conhecidas como doenças conformacionais, entre as quais se destacam o cancro e doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson. O proteassoma 26S é a forma constitutiva do proteassoma e é o local onde ocorre a degradação de proteínas marcadas com ubiquitina. Nos vertebrados podem ser encontradas três classes diferentes de proteassomas: timoproteassoma, imunoproteassoma e proteassoma constitutivo. O imunoproteassoma é maioritariamente expresso nas células que fazem parte do sistema imunitário, podendo, no entanto, também ser induzida a sua expressão noutro tipo de células durante processos de inflamação e na presença de certas citoquinas. Consequentemente, este tipo de proteassoma está geralmente associado a doenças inflamatórias, autoimunes, neurodegenerativas e até mesmo cancerígenas. Assim, o uso de inibidores do proteassoma de forma geral e específicos para o imunoproteassoma parece ser uma estratégia potencial de auxílio na terapia deste tipo de doenças. O objetivo principal desta tese de mestrado foi estudar o potencial efeito de inibidores do proteassoma e de diferentes subunidades do imunoproteassoma nos processos de diferenciação e ativação de células dendríticas primárias humanas. Para tal, utilizámos inibidores seletivos do (imuno)proteassoma: LU-001c, LU-001i, NC-001, LU-002c, LU-002i, LU-102, LU-025c e LU-015i, os quais foram fornecidos pelo Prof. Dr. H.S. Overkleeft (Leiden University, Netherlands). O primeiro segmento experimental realizado teve o objetivo de investigar o potencial efeito dos inibidores no processo de diferenciação das células dendríticas a partir de monócitos. Observámos que a presença dos inibidores levava a uma menor expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto nenhum efeito se registava nos marcadores CD14, CD80 e CD86. Observámos também que este efeito era mais proeminente na presença de inibidores seletivos das subunidades catalíticas do imunoproteassoma. Tal indica que os inibidores do imunoproteassoma podem levar à supressão da diferenciação dos monócitos a células dendríticas imaturas e consequentemente a uma menor ativação das células T CD4+. Determinámos também os níveis de secreção por parte das células dendríticas das citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ na presença ou ausência de inibidores seletivos do imunoproteassoma. No entanto, nenhum efeito significativo foi observado com os inibidores e citoquinas estudados. Concluímos que no futuro outras citoquinas que se relacionem mais com as células dendríticas devem ser igualmente estudadas e investigadas. De seguida, realizámos duas experiências diferentes onde (i) tratámos os monócitos com inibidores apenas durante o seu processo de diferenciação a células dendríticas imaturas ou (ii) tratámos as células com inibidores durante os processos de diferenciação e maturação das células dendríticas. No primeiro caso, observámos resultados díspares na expressão dos marcadoes. Uma inibição das subunidades β5c e β5i simultãnea levou a uma diminuição notável da expressão dos marcadores CD80, CD86 e CD14, indicando uma menor maturação das células dendríticas. Contrariamente, perante um inibidor da subunidade β2i utilizado sozinho ou em conjunto com outros inibidores, observámos um ligeiro aumento da expressão do marcador DC-SIGN. Isto pode significar que diferentes subunidades catalíticas do imunoproteassoma estão envolvidas em vias intracelulares diferentes, o que explicar os diferentes fenótipos observados. Por outro lado, se os inibidores estavam presentes durante a diferenciação e maturação das células, foi possível observar um aumento significativo na expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto CD80, CD86 e CD14 apenas foram afetados minimamente ou nada. Tal indica que a presença dos inibidores alterou as células dendríticas para um estado mais maduro. É de notar também, que de todos os inibidores utilizados durante este trabalho experimental, o inibidor da subunidade β5i, LU-015i, quando utilizado em combinação com outros inibidores parece ter um efeito inibidor sobre o imunoproteassoma mais potente. Deste modo, podemos afirmar que a modulação do (imuno)proteassoma parece ter um papel relevante no desenvolvimento das células dendríticas. No entanto, realçamos que são necessárias realizar mais repetições, modificações experimentais e diferentes testes no futuro de modo a melhor elucidar o papel do imunoproteassoma na diferenciação e maturação das células dendríticas.
Autores principais:	Rodrigues, Raquel Alcarpe Coelho Gomes
Assunto:	Sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) Proteassoma Imunoproteassoma Doenças Cancro Inibidores Células dendríticas Monócitos Diferenciação Maturação. Mestrado Integrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Muitos processos fisiológicos e patológicos dependem do funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). Este sistema é responsável pela degradação da maior parte das proteínas nas células eucarióticas. As proteínas são biomoléculas de nitrogénio de elevadas dimensões formadas por resíduos de aminoácidos e que possuem funções complexas que permitem o bom funcionamento do organismo. Deste modo, torna-se essencial manter a integridade celular das proteínas dentro de valores aceitáveis para garantir o seu correto funcionamento. Da incorreta conformação e agregação das proteínas podem surgir diversas doenças conhecidas como doenças conformacionais, entre as quais se destacam o cancro e doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson. O proteassoma 26S é a forma constitutiva do proteassoma e é o local onde ocorre a degradação de proteínas marcadas com ubiquitina. Nos vertebrados podem ser encontradas três classes diferentes de proteassomas: timoproteassoma, imunoproteassoma e proteassoma constitutivo. O imunoproteassoma é maioritariamente expresso nas células que fazem parte do sistema imunitário, podendo, no entanto, também ser induzida a sua expressão noutro tipo de células durante processos de inflamação e na presença de certas citoquinas. Consequentemente, este tipo de proteassoma está geralmente associado a doenças inflamatórias, autoimunes, neurodegenerativas e até mesmo cancerígenas. Assim, o uso de inibidores do proteassoma de forma geral e específicos para o imunoproteassoma parece ser uma estratégia potencial de auxílio na terapia deste tipo de doenças. O objetivo principal desta tese de mestrado foi estudar o potencial efeito de inibidores do proteassoma e de diferentes subunidades do imunoproteassoma nos processos de diferenciação e ativação de células dendríticas primárias humanas. Para tal, utilizámos inibidores seletivos do (imuno)proteassoma: LU-001c, LU-001i, NC-001, LU-002c, LU-002i, LU-102, LU-025c e LU-015i, os quais foram fornecidos pelo Prof. Dr. H.S. Overkleeft (Leiden University, Netherlands). O primeiro segmento experimental realizado teve o objetivo de investigar o potencial efeito dos inibidores no processo de diferenciação das células dendríticas a partir de monócitos. Observámos que a presença dos inibidores levava a uma menor expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto nenhum efeito se registava nos marcadores CD14, CD80 e CD86. Observámos também que este efeito era mais proeminente na presença de inibidores seletivos das subunidades catalíticas do imunoproteassoma. Tal indica que os inibidores do imunoproteassoma podem levar à supressão da diferenciação dos monócitos a células dendríticas imaturas e consequentemente a uma menor ativação das células T CD4+. Determinámos também os níveis de secreção por parte das células dendríticas das citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ na presença ou ausência de inibidores seletivos do imunoproteassoma. No entanto, nenhum efeito significativo foi observado com os inibidores e citoquinas estudados. Concluímos que no futuro outras citoquinas que se relacionem mais com as células dendríticas devem ser igualmente estudadas e investigadas. De seguida, realizámos duas experiências diferentes onde (i) tratámos os monócitos com inibidores apenas durante o seu processo de diferenciação a células dendríticas imaturas ou (ii) tratámos as células com inibidores durante os processos de diferenciação e maturação das células dendríticas. No primeiro caso, observámos resultados díspares na expressão dos marcadoes. Uma inibição das subunidades β5c e β5i simultãnea levou a uma diminuição notável da expressão dos marcadores CD80, CD86 e CD14, indicando uma menor maturação das células dendríticas. Contrariamente, perante um inibidor da subunidade β2i utilizado sozinho ou em conjunto com outros inibidores, observámos um ligeiro aumento da expressão do marcador DC-SIGN. Isto pode significar que diferentes subunidades catalíticas do imunoproteassoma estão envolvidas em vias intracelulares diferentes, o que explicar os diferentes fenótipos observados. Por outro lado, se os inibidores estavam presentes durante a diferenciação e maturação das células, foi possível observar um aumento significativo na expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto CD80, CD86 e CD14 apenas foram afetados minimamente ou nada. Tal indica que a presença dos inibidores alterou as células dendríticas para um estado mais maduro. É de notar também, que de todos os inibidores utilizados durante este trabalho experimental, o inibidor da subunidade β5i, LU-015i, quando utilizado em combinação com outros inibidores parece ter um efeito inibidor sobre o imunoproteassoma mais potente. Deste modo, podemos afirmar que a modulação do (imuno)proteassoma parece ter um papel relevante no desenvolvimento das células dendríticas. No entanto, realçamos que são necessárias realizar mais repetições, modificações experimentais e diferentes testes no futuro de modo a melhor elucidar o papel do imunoproteassoma na diferenciação e maturação das células dendríticas.