Publicação

Using TUDCA to treat Alzheimer's disease after pathology onset in APP/PS1 mice

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência, constituindo um problema de saúde pública grave, devido ao aumento da esperança média de vida da população mundial, bem como ao longo período de progressão desta doença incapacitante. A AD é caracterizada, em termos patológicos, por acumulação de péptido amilóide-β (Aβ), a nível extracelular e de tranças neurofibrilares intraneuronais, compostas por agregados de proteína tau hiperfosforilada, em regiões cerebrais específicas. A neuroinflamação crónica e a perda progressiva de neurónios, sinapses e matéria branca são características adicionais que também estão associadas à doença. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) é um ácido biliar endógeno, anti-apoptótico, capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e que apresenta fortes propriedades neuroprotectoras, em diversos modelos experimentais de AD. Resultados obtidos anteriormente pelo nosso grupo demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA em murganhos duplamente transgénicos APP/PS1, antes de estes apresentarem deposição de placas amilóides. Neste estudo, o tratamento preventivo com TUDCA resultou, não só na diminuição da produção e acumulação de Aβ, como também na redução da activação da resposta glial face à acumulação de agregados amilóides. É de salientar que o tratamento com TUDCA conduziu a melhorias na memória dos animais, o que poderá estar relacionado com a diminuição da perda de sinapses, também observada. No estudo agora apresentado, pretendeu-se avaliar os efeitos protetores do TUDCA, quando administrado após o desenvolvimento da patologia amilóide no mesmo modelo transgénico de AD. Os murganhos APP/PS1 com 7 meses de idade foram injetados intraperitonealmente com TUDCA (500 mg/kg), a cada 3 dias, durante 3 meses. Após a realização do teste aquático de Morris, destinado à avaliação da memória espacial dos murganhos, os animais foram sacrificados e um dos hemisférios cerebrais foi processado para análise imunohistoquímica (IHC). O outro hemisfério foi preservado para isolamento do hipocampo e córtex frontal e posterior extração de RNA e proteínas. xii O tratamento com TUDCA levou a uma diminuição significativa da deposição de Aβ em ambas as regiões cerebrais analisadas, com uma maior redução detetada no hipocampo. Esta observação explica-se, provavelmente, pelo facto de neste modelo transgénico, o hipocampo apresentar placas amilóides apenas a partir dos 2-3 meses, enquanto que o neocórtex apresenta depósitos de Aβ logo a partir das 6 semanas. Contudo, ensaios de ELISA confirmaram que os níveis de Aβ40 e Aβ42 estavam significativamente diminuídos em ambas as regiões, após o tratamento com TUDCA. Estes resultados estão de acordo com a diminuição do processamento amiloidogénico da proteína precursora do Aβ (APP) observada no córtex e hipocampo, e sugerem que o tratamento com TUDCA interfere na produção de Aβ. Avaliaram-se também os níveis de fosforilação de resíduos específicos da proteína cinase B, ou Akt, e da cinase da glicogénio sintase 3β (GSK3β), que se relacionam indiretamente com os seus níveis de atividade. A enzima Akt, quando ativa, encontra-se fosforilada no resíduo de serina 473, podendo então fosforilar a GSK3β na serina 9, o que inibe a atividade desta. É de salientar que o eixo Akt/GSK3β se encontra desregulado na AD. A enzima Akt é alvo da via controlada pela fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), estando ambas envolvidas na ativação de mecanismos de sobrevivência neuronal e de potenciação sinática. A GSK3β encontra-se amplamente descrita como estando hiperativada na AD, ,parecendo envolvida em inúmeros processos associados à progressão da doença. Por exemplo, a GSK3β é uma das principais enzimas responsáveis pela fosforilação de vários resíduos da proteína tau, pelo que a sua desregulação se encontra associada à hiperfosforilação da tau. Mais ainda, a GSK3β tem a capacidade de fosforilar a APP num resíduo citoplasmático, o que pode contribuir para a produção de Aβ. Curiosamente, a inibição da atividade desta cinase parece diminuir a expressão da β-secretase (BACE1), reduzindo o processamento amiloidogénico da APP e, consequente, a produção de Aβ. A GSK3β surgiu recentemente como um mediador-chave da ativação microglial e astroglial em condições inflamatórias, incluindo na AD. Neste sentido, a inibição desta cinase in vivo tem o potencial de melhorar significativamente as patologias associadas à AD. Como seria de esperar, a análise por Western blot (WB) revelou uma diminuição dos níveis de fosforilação da Akt e da GSK3β no córtex, bem como uma diminuição nos níveis de fosforilação da GSK3β no hipocampo de murganhos APP/PS1. Em contrapartida, os animais transgénicos tratados com TUDCA apresentaram níveis de fosforilação destas enzimas semelhantes aos detetados nos murganhos controlo, o que sugere que o TUDCA normaliza os níveis de atividade destas enzimas, no contexto da AD. Os níveis de fosforilação do resíduo de serina 396 da proteína tau, que se encontram aumentados nos murganhos APP/PS1, foram igualmente diminuídos pelo tratamento com TUDCA. Como este resíduo é um alvo importante da GSK3β, a diminuição dos seus níveis de fosforilação poderão indicar a reposição da atividade da GSK3β pelo TUDCA. Verificou-se ainda que, ao contrário do esperado, o tratamento com TUDCA não afetou o nível de fosforilação da APP e a quantidade de BACE1 presente nos cérebros dos murganhos transgénicos tratados, face ao observado nos murganhos transgénicos não tratados, indicando que a atividade desregulada da GSK3β não modula estas vias neste modelo animal, ou que outros mecanismos moleculares poderão estar envolvidos. Neste estudo, e à semelhança de outros anteriores, o tratamento com TUDCA atenuou significativamente a ativação pro-inflamatória dos astrócitos e da microglia em redor das placas amilóides. De igual modo, o tratamento com TUDCA conduziu a uma diminuição significativa dos níveis de mRNA do factor de necrose tumoral α (TNFα), uma das citocinas pro-inflamatórias aumentadas na AD e envolvidas na progressão da doença. Relativamente ao conteúdo sinático, detetou-se uma diminuição nos níveis da proteína sinaptofisina no giro denteado do hipocampo de murganhos APP/PS1, que se correlaciona com a disfunção destas estruturas e a desregulação neurológica generalizada. Esta redução foi parcialmente revertida nos animais tratados com TUDCA, podendo dever-se ao aumento de atividade da cinase Akt que se encontra envolvida na potenciação da resposta sinática ou, simplesmente, à diminuição dos níveis de Aβ. Contudo, os estudos comportamentais permitiram concluir que o tratamento tardio com TUDCA, apesar de melhorar alguns aspetos da patologia, ao nível molecular, não melhora significativamente a perda de memória espacial dos murganhos APP/PS1, tendo-se observado apenas uma tendência para tal. Esta observação poderá advir do facto destes animais já manifestarem défices de memória desde os 7 meses de idade, altura em que se iniciou o tratamento com TUDCA. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA quando administrado a murganhos APP/PS1 já com características patológicas associadas à AD. O TUDCA atenua a produção e deposição de Aβ, a hiperfosforilação da proteína tau, a activação glial e a perda de integridade sináptica, sendo que vários destes efeitos poderão dever-se, especificamente, à modulação da via Akt/GSK3β. Estes dados sugerem que a utilização do TUDCA não reverte as condições patológicas associadas à perda de memória emergentes ou já existentes na AD sendo, no entanto, uma estratégia terapêutica promissora para atenuar ou retardar a progressão da doença.
Autores principais:	Dionísio, Pedro Elói Antunes
Assunto:	Amyloid-β Amyloid precursor protein APP/PS1 mice Glycogen synthase kinase β Neuroinflammation Tau TUDCA Teses de mestrado - 2014
Ano:	2014
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência, constituindo um problema de saúde pública grave, devido ao aumento da esperança média de vida da população mundial, bem como ao longo período de progressão desta doença incapacitante. A AD é caracterizada, em termos patológicos, por acumulação de péptido amilóide-β (Aβ), a nível extracelular e de tranças neurofibrilares intraneuronais, compostas por agregados de proteína tau hiperfosforilada, em regiões cerebrais específicas. A neuroinflamação crónica e a perda progressiva de neurónios, sinapses e matéria branca são características adicionais que também estão associadas à doença. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) é um ácido biliar endógeno, anti-apoptótico, capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e que apresenta fortes propriedades neuroprotectoras, em diversos modelos experimentais de AD. Resultados obtidos anteriormente pelo nosso grupo demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA em murganhos duplamente transgénicos APP/PS1, antes de estes apresentarem deposição de placas amilóides. Neste estudo, o tratamento preventivo com TUDCA resultou, não só na diminuição da produção e acumulação de Aβ, como também na redução da activação da resposta glial face à acumulação de agregados amilóides. É de salientar que o tratamento com TUDCA conduziu a melhorias na memória dos animais, o que poderá estar relacionado com a diminuição da perda de sinapses, também observada. No estudo agora apresentado, pretendeu-se avaliar os efeitos protetores do TUDCA, quando administrado após o desenvolvimento da patologia amilóide no mesmo modelo transgénico de AD. Os murganhos APP/PS1 com 7 meses de idade foram injetados intraperitonealmente com TUDCA (500 mg/kg), a cada 3 dias, durante 3 meses. Após a realização do teste aquático de Morris, destinado à avaliação da memória espacial dos murganhos, os animais foram sacrificados e um dos hemisférios cerebrais foi processado para análise imunohistoquímica (IHC). O outro hemisfério foi preservado para isolamento do hipocampo e córtex frontal e posterior extração de RNA e proteínas. xii O tratamento com TUDCA levou a uma diminuição significativa da deposição de Aβ em ambas as regiões cerebrais analisadas, com uma maior redução detetada no hipocampo. Esta observação explica-se, provavelmente, pelo facto de neste modelo transgénico, o hipocampo apresentar placas amilóides apenas a partir dos 2-3 meses, enquanto que o neocórtex apresenta depósitos de Aβ logo a partir das 6 semanas. Contudo, ensaios de ELISA confirmaram que os níveis de Aβ40 e Aβ42 estavam significativamente diminuídos em ambas as regiões, após o tratamento com TUDCA. Estes resultados estão de acordo com a diminuição do processamento amiloidogénico da proteína precursora do Aβ (APP) observada no córtex e hipocampo, e sugerem que o tratamento com TUDCA interfere na produção de Aβ. Avaliaram-se também os níveis de fosforilação de resíduos específicos da proteína cinase B, ou Akt, e da cinase da glicogénio sintase 3β (GSK3β), que se relacionam indiretamente com os seus níveis de atividade. A enzima Akt, quando ativa, encontra-se fosforilada no resíduo de serina 473, podendo então fosforilar a GSK3β na serina 9, o que inibe a atividade desta. É de salientar que o eixo Akt/GSK3β se encontra desregulado na AD. A enzima Akt é alvo da via controlada pela fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), estando ambas envolvidas na ativação de mecanismos de sobrevivência neuronal e de potenciação sinática. A GSK3β encontra-se amplamente descrita como estando hiperativada na AD, ,parecendo envolvida em inúmeros processos associados à progressão da doença. Por exemplo, a GSK3β é uma das principais enzimas responsáveis pela fosforilação de vários resíduos da proteína tau, pelo que a sua desregulação se encontra associada à hiperfosforilação da tau. Mais ainda, a GSK3β tem a capacidade de fosforilar a APP num resíduo citoplasmático, o que pode contribuir para a produção de Aβ. Curiosamente, a inibição da atividade desta cinase parece diminuir a expressão da β-secretase (BACE1), reduzindo o processamento amiloidogénico da APP e, consequente, a produção de Aβ. A GSK3β surgiu recentemente como um mediador-chave da ativação microglial e astroglial em condições inflamatórias, incluindo na AD. Neste sentido, a inibição desta cinase in vivo tem o potencial de melhorar significativamente as patologias associadas à AD. Como seria de esperar, a análise por Western blot (WB) revelou uma diminuição dos níveis de fosforilação da Akt e da GSK3β no córtex, bem como uma diminuição nos níveis de fosforilação da GSK3β no hipocampo de murganhos APP/PS1. Em contrapartida, os animais transgénicos tratados com TUDCA apresentaram níveis de fosforilação destas enzimas semelhantes aos detetados nos murganhos controlo, o que sugere que o TUDCA normaliza os níveis de atividade destas enzimas, no contexto da AD. Os níveis de fosforilação do resíduo de serina 396 da proteína tau, que se encontram aumentados nos murganhos APP/PS1, foram igualmente diminuídos pelo tratamento com TUDCA. Como este resíduo é um alvo importante da GSK3β, a diminuição dos seus níveis de fosforilação poderão indicar a reposição da atividade da GSK3β pelo TUDCA. Verificou-se ainda que, ao contrário do esperado, o tratamento com TUDCA não afetou o nível de fosforilação da APP e a quantidade de BACE1 presente nos cérebros dos murganhos transgénicos tratados, face ao observado nos murganhos transgénicos não tratados, indicando que a atividade desregulada da GSK3β não modula estas vias neste modelo animal, ou que outros mecanismos moleculares poderão estar envolvidos. Neste estudo, e à semelhança de outros anteriores, o tratamento com TUDCA atenuou significativamente a ativação pro-inflamatória dos astrócitos e da microglia em redor das placas amilóides. De igual modo, o tratamento com TUDCA conduziu a uma diminuição significativa dos níveis de mRNA do factor de necrose tumoral α (TNFα), uma das citocinas pro-inflamatórias aumentadas na AD e envolvidas na progressão da doença. Relativamente ao conteúdo sinático, detetou-se uma diminuição nos níveis da proteína sinaptofisina no giro denteado do hipocampo de murganhos APP/PS1, que se correlaciona com a disfunção destas estruturas e a desregulação neurológica generalizada. Esta redução foi parcialmente revertida nos animais tratados com TUDCA, podendo dever-se ao aumento de atividade da cinase Akt que se encontra envolvida na potenciação da resposta sinática ou, simplesmente, à diminuição dos níveis de Aβ. Contudo, os estudos comportamentais permitiram concluir que o tratamento tardio com TUDCA, apesar de melhorar alguns aspetos da patologia, ao nível molecular, não melhora significativamente a perda de memória espacial dos murganhos APP/PS1, tendo-se observado apenas uma tendência para tal. Esta observação poderá advir do facto destes animais já manifestarem défices de memória desde os 7 meses de idade, altura em que se iniciou o tratamento com TUDCA. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA quando administrado a murganhos APP/PS1 já com características patológicas associadas à AD. O TUDCA atenua a produção e deposição de Aβ, a hiperfosforilação da proteína tau, a activação glial e a perda de integridade sináptica, sendo que vários destes efeitos poderão dever-se, especificamente, à modulação da via Akt/GSK3β. Estes dados sugerem que a utilização do TUDCA não reverte as condições patológicas associadas à perda de memória emergentes ou já existentes na AD sendo, no entanto, uma estratégia terapêutica promissora para atenuar ou retardar a progressão da doença.