Publicação

Production of therapeutic Plasmid DNA by Lactic Acid Bacteria

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As vacinas baseadas em DNA plasmídico são uma alternativa mais segura relativamente às tradicionais, podendo ser estes vetores produzidos mais rapidamente e com maior facilidade no geral. Escherichia coli é o hospedeiro mais comum para a produção de vacinas de DNA. Contudo estas bactérias gram negativas possuem na sua membrana externa lipopolissacarídeos, uma endotoxina que se liga a um complexo de recetores CD14/TLR4/MD2, ativando a cascata do complemento e que resulta numa reação inflamatória grave. Assim, este trabalho pretende desenvolver uma alternativa mais segura para as vacinas de DNA em bactérias ácido lácticas uma vez que são comumente utilizadas na indústria alimentar, são consideradas como probióticos e usadas para a expressão de proteínas heterólogas. O crescimento para duas estirpes (Lactococcus lactis LMG 19460 e Lactobacillus plantarum CCUG 61730) foi optimizado em pequena escala (crescimento em falcon), chegando-se à escala de 1 litro de cultura celular em condições anaeróbias. Para o processo de eletrotransformação só o baseado em NaCl foi eficiente para a transformação de L. lactis LMG 19460, não se tendo obtido transformantes para L. plantarum CCUG 61730. Neste trabalho construiu-se um plasmídeo modificado por alteração do Ribosome binding site (RBS) de forma a aumentar o número de cópias de plasmídeo em bactérias lácticas. A quantificação relativa do número de cópias do plasmídeo foi realizada por PCR em tempo real e como análise complementar utilizou-se a quantificação por absorvância a 260nm após purificação do plasmídeo. Embora haja alguma variação, parece existir um aumento do número de cópias do pTRKH3 em L. lactis LMG 19460 em 4 colónias. No entanto para outras colónias este aumento não foi tão evidente. A sequência modificada do RBS foi confirmada por sequenciação para os clones mais produtores e para os restantes. Finalmente, melhorou-se o rendimento de purificação (cerca de 3000%) dos plasmídeos adicionando 10mg/ml de lisozima durante o passo de lise celular.
Autores principais:	Andrade, Sílvia Marina de Jesus, 1986-
Assunto:	Plasmídeos Escherichia coli Lactococcus lactis Lactobacillus plantarum Teses de mestrado - 2014
Ano:	2014
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As vacinas baseadas em DNA plasmídico são uma alternativa mais segura relativamente às tradicionais, podendo ser estes vetores produzidos mais rapidamente e com maior facilidade no geral. Escherichia coli é o hospedeiro mais comum para a produção de vacinas de DNA. Contudo estas bactérias gram negativas possuem na sua membrana externa lipopolissacarídeos, uma endotoxina que se liga a um complexo de recetores CD14/TLR4/MD2, ativando a cascata do complemento e que resulta numa reação inflamatória grave. Assim, este trabalho pretende desenvolver uma alternativa mais segura para as vacinas de DNA em bactérias ácido lácticas uma vez que são comumente utilizadas na indústria alimentar, são consideradas como probióticos e usadas para a expressão de proteínas heterólogas. O crescimento para duas estirpes (Lactococcus lactis LMG 19460 e Lactobacillus plantarum CCUG 61730) foi optimizado em pequena escala (crescimento em falcon), chegando-se à escala de 1 litro de cultura celular em condições anaeróbias. Para o processo de eletrotransformação só o baseado em NaCl foi eficiente para a transformação de L. lactis LMG 19460, não se tendo obtido transformantes para L. plantarum CCUG 61730. Neste trabalho construiu-se um plasmídeo modificado por alteração do Ribosome binding site (RBS) de forma a aumentar o número de cópias de plasmídeo em bactérias lácticas. A quantificação relativa do número de cópias do plasmídeo foi realizada por PCR em tempo real e como análise complementar utilizou-se a quantificação por absorvância a 260nm após purificação do plasmídeo. Embora haja alguma variação, parece existir um aumento do número de cópias do pTRKH3 em L. lactis LMG 19460 em 4 colónias. No entanto para outras colónias este aumento não foi tão evidente. A sequência modificada do RBS foi confirmada por sequenciação para os clones mais produtores e para os restantes. Finalmente, melhorou-se o rendimento de purificação (cerca de 3000%) dos plasmídeos adicionando 10mg/ml de lisozima durante o passo de lise celular.