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Alpha-synuclein phosphorylation role on Parkinson's disease

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A incorreta aquisição da estrutura final e consequente agregação de proteínas são a principal causa para o desenvolvimento de patologias neuro-degenerativas, tais como a doença de Parkinson (DP), de Alzheimer (DA) e Huntington (DH). A DP é a segunda mais comum doença neuro-degenerativa, afetando entre 1 a 2% da população acima dos 60 anos de idade nos países industrializados, sendo a Europa o continente mais afetado. Clinicamente, esta doença é caracterizada por tremor e rigidez musculares e instabilidade postural e de marcha. Eventualmente, há ainda o aparecimento de sintomas não-motores, tais como psicose e demência. Os sintomas motores, apenas detetados no momento do diagnóstico, ocorrem quando já uma significativa parte da população neuronal foi afetada e atualmente, a estratégia de tratamento é ainda paliativa, em vez de curativa. Patologicamente, a DP caracteriza-se pela acumulação da proteína α-Synucleína (αSyn), que forma inclusões intracelulares designadas por corpos de Lewis (CLs), causando a perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na região cerebral da Substantia Nigra (SN) pars compacta e, em estádios mais avançados da doença, espalhando-se às restantes populações neuronais. Atualmente, é aceite que o papel pato-fisiológico da αSyn reside na sua agregação, no entanto, é ainda desconhecido quais os fatores que desencadeiam esse mesmo evento, assim como quais os mecanismos celulares e quais os intermediários proteicos responsáveis pela neuro-toxicidade. A DP tem duas variantes, que têm como elo comum a agregação da αSyn: a esporádica e a familiar (menos de 10% dos casos). Assim, o estudo de uma das formas contribui para a compreensão do mecanismo patológico da outra. A forma esporádica da doença é desencadeada principalmente pela idade avançada e/ou fatores ambientais, enquanto a forma familiar ocorre prematuramente e com um fenótipo mais severo e é caracterizada pela existência de predisposições e mutações genéticas. No caso da αSyn, mutações que originam duplicações e triplicações do gene que codifica esta proteína (gene SNCA), assim como as substituições de aminoácidos A30P, E46K, H50Q, G51D A53T e A53E na sequência da αSyn foram identificadas como associadas à forma familiar de DP. Adicionalmente, modificações pós-traducionais (MPTs) da αSyn, tais como a fosforilação do resíduo de serina S129, que em 90% da αSyn nos CLs se encontra fosforilada, em contraste com os 4% em condições fisiológicas, e recentemente, a identificação de aumento da fosforilação do resíduo de serina S87, estão associadas a ambas as formas esporádica e familiar da doença. No entanto, os mecanismos celulares e a toxicidade intrínseca pelos quais as mutações familiares contribuem para o papel neuropatológico da αSyn são ainda desconhecidos, assim como o papel neuro-protetor ou prejudicial da fosforilação da αSyn é ainda alvo de debate, já que diferentes modelos celulares apresentam diferentes efeitos na toxicidade da αSyn, quando fosforilada no resíduo S129. Em relação ao papel patológico da fosforilação do resíduo S87, este ainda não foi totalmente explorado, principalmente devido a duas principais limitações: este resíduo não é conservado entre espécies, o que dificulta o estabelecimento de conclusões de modelos de ratinhos para humanos, e é apenas fosforilável em humanos, o que evidencia um papel importante deste resíduo no desenvolvimento da DP. A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um organismo unicelular que partilha um elevado grau de conservação de várias vias celulares básicas com outros eucariotas superiores, tais como o ser humano, como por exemplo o controlo de qualidade proteico. Este organismo foi estabelecido como um modelo celular para a compreensão de diversos mecanismos biológicos, assim como no estudo de doenças neuro-degenerativas. Nomeadamente, o estudo dos processos de fosforilação e agregação da αSyn, assim como a pato-biologia desta proteína são passíveis de ser estudados neste organismo, uma vez que em levedura foi previamente demonstrado que a expressão da αSyn humana induz a formação de inclusões citoplasmáticas e confere toxicidade às células, de forma semelhante ao que ocorre não só noutros modelos biológicos, como ratinho e linhas celulares de mamífero, como também nos cérebros de pacientes com DP. Adicionalmente, a utilização deste organismo confere várias vantagens, como o a sua facilidade de manipulação, o curto tempo de geração, o genoma estar sequenciado e devidamente anotado em bases de dados e ser facilmente manipulável geneticamente. Assim, utilizando a levedura como modelo celular, este projeto teve como objetivos abordar a pato-biologia da αSyn em ambas as vertentes esporádica e familiar da DP, nomeadamente A) na caracterização fenotípica da mais recentemente mutação identificada como associada a DP familiar, a mutação da αSyn A53E e B) o estudo da interação da fosforilação entre os resíduos S87 e S129. Para atingir os objetivos propostos, o fenótipo da mutação A53E foi caracterizado recorrendo à avaliação da viabilidade celular, formação de inclusões, expressão e fosforilação da αSyn, solubilidade dos agregados de αSyn e avaliação das alterações da rede mitocondrial. O efeito da fosforilação nos resíduos S129 e S87 foi estudado utilizando estirpes de levedura com o gene que codifica a proteína αSyn humana integrado no genoma, usando diferentes versões mutadas da αSyn, nomeadamente, mutantes que mimetizam e bloqueiam a fosforilação no resíduo S129, os mutantes S129D e S129A, respetivamente, o mutante que mimetiza a fosforilação no resíduo S87 (S87E) e um duplo mutante que mimetiza a simultânea fosforilação no resíduo S87 e S129 (S87E_S129D). Para este grupo de fosfo-mutantes foram avaliados os parâmetros de viabilidade celular, formação de inclusões, expressão, fosforilação e remoção intracelular da αSyn e a função dos mecanismos de manutenção da qualidade celular (função proteossomal e autofágica). Resultante desta análise, foi observado que a expressão da proteína mutante A53E αSyn não resulta em diferenças significativas no fenótipo dos parâmetros avaliados, quando comparado com a expressão da proteína nativa (WT). De facto, a expressão da mutação A53E induz toxicidade e formação de inclusões, mas de forma equivalente à proteína WT, embora com tendência para diminuir o número de inclusões e ainda, relativamente à natureza das inclusões, a solubilidade das inclusões aparenta ser semelhante à proteína WT. Estes resultados estão em parte em concordância com estudos in vitro realizados, que descrevem um fenótipo da A53E de toxicidade celular semelhante à proteína WT. Relativamente ao estudo da interação da fosforilação entre os resíduos S87 e S129, foi observado que quando a fosforilação no resíduo S87 é mimetizada (mutante S87E), a formação de inclusões e toxicidade conferidas pela αSyn aumentam significativamente (aproximadamente 80% de células com inclusões), causando a perda de função proteossomal e ativando a autofagia, quando comparando com a expressão da proteína WT. Surpreendentemente, quando a mutação S87E foi acoplada à mutação que mimetiza a fosforilação no resíduo S129 (mutante S87E_S129D), o fenótipo de toxicidade induzindo pelo mutante S87E é inexistente, prevalecendo um suposto efeito protetor da fosforilação no resíduo S129 (mutante S129D). Adicionalmente, é possível observar que o mutante S87E_S129D tem menos formação de inclusões e apresenta menos toxicidade que a expressão da proteína WT, o que permite inferir que não só prevalece o efeito protetor da mutação S129D sobre o efeito tóxico da mutação S87E, como também poderá existir um efeito sinérgico neuro-protetor quando ambos os resíduos se encontram fosforilados simultaneamente. Explorar os mecanismos específicos com outros organelos assim como os eventos iniciais da agregação, nomeadamente aquando da presença de mutações familiares, é crucial para a determinação de como a αSyn induz toxicidade celular no caso da forma familiar de DP. Em relação ao papel da fosforilação na patogénese de PD, o presente estudo evidencia a importância do estudo de padrões de ativação/desativação de diferentes resíduos. Embora o presente trabalho suporte a ideia de um papel neuro-protetor da fosforilação do resíduo S129 da αSyn, assim como quando esta fosforilação é acoplada à fosforilação no resíduo S87, outras abordagens relativamente a outros padrões de MPTs e outros resíduos de fosforilação, como os restantes resíduos de tirosina, assim como o efeito destes padrões em organelos celulares específicos devem ser seguidos no futuro. As contribuições do presente trabalho, assim como um esforço futuro para a compreensão do efeito de alterações da αSyn no seu comportamento e na proteostase celular, são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégicas terapêuticas, no contexto da DP e de outras synucleinopatias.
Autores principais:	Madaleno, Carolina da Silva
Assunto:	Doença de Parkinson α-Synuclein Agregação Mutações familiares Fosforilação Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A incorreta aquisição da estrutura final e consequente agregação de proteínas são a principal causa para o desenvolvimento de patologias neuro-degenerativas, tais como a doença de Parkinson (DP), de Alzheimer (DA) e Huntington (DH). A DP é a segunda mais comum doença neuro-degenerativa, afetando entre 1 a 2% da população acima dos 60 anos de idade nos países industrializados, sendo a Europa o continente mais afetado. Clinicamente, esta doença é caracterizada por tremor e rigidez musculares e instabilidade postural e de marcha. Eventualmente, há ainda o aparecimento de sintomas não-motores, tais como psicose e demência. Os sintomas motores, apenas detetados no momento do diagnóstico, ocorrem quando já uma significativa parte da população neuronal foi afetada e atualmente, a estratégia de tratamento é ainda paliativa, em vez de curativa. Patologicamente, a DP caracteriza-se pela acumulação da proteína α-Synucleína (αSyn), que forma inclusões intracelulares designadas por corpos de Lewis (CLs), causando a perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na região cerebral da Substantia Nigra (SN) pars compacta e, em estádios mais avançados da doença, espalhando-se às restantes populações neuronais. Atualmente, é aceite que o papel pato-fisiológico da αSyn reside na sua agregação, no entanto, é ainda desconhecido quais os fatores que desencadeiam esse mesmo evento, assim como quais os mecanismos celulares e quais os intermediários proteicos responsáveis pela neuro-toxicidade. A DP tem duas variantes, que têm como elo comum a agregação da αSyn: a esporádica e a familiar (menos de 10% dos casos). Assim, o estudo de uma das formas contribui para a compreensão do mecanismo patológico da outra. A forma esporádica da doença é desencadeada principalmente pela idade avançada e/ou fatores ambientais, enquanto a forma familiar ocorre prematuramente e com um fenótipo mais severo e é caracterizada pela existência de predisposições e mutações genéticas. No caso da αSyn, mutações que originam duplicações e triplicações do gene que codifica esta proteína (gene SNCA), assim como as substituições de aminoácidos A30P, E46K, H50Q, G51D A53T e A53E na sequência da αSyn foram identificadas como associadas à forma familiar de DP. Adicionalmente, modificações pós-traducionais (MPTs) da αSyn, tais como a fosforilação do resíduo de serina S129, que em 90% da αSyn nos CLs se encontra fosforilada, em contraste com os 4% em condições fisiológicas, e recentemente, a identificação de aumento da fosforilação do resíduo de serina S87, estão associadas a ambas as formas esporádica e familiar da doença. No entanto, os mecanismos celulares e a toxicidade intrínseca pelos quais as mutações familiares contribuem para o papel neuropatológico da αSyn são ainda desconhecidos, assim como o papel neuro-protetor ou prejudicial da fosforilação da αSyn é ainda alvo de debate, já que diferentes modelos celulares apresentam diferentes efeitos na toxicidade da αSyn, quando fosforilada no resíduo S129. Em relação ao papel patológico da fosforilação do resíduo S87, este ainda não foi totalmente explorado, principalmente devido a duas principais limitações: este resíduo não é conservado entre espécies, o que dificulta o estabelecimento de conclusões de modelos de ratinhos para humanos, e é apenas fosforilável em humanos, o que evidencia um papel importante deste resíduo no desenvolvimento da DP. A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um organismo unicelular que partilha um elevado grau de conservação de várias vias celulares básicas com outros eucariotas superiores, tais como o ser humano, como por exemplo o controlo de qualidade proteico. Este organismo foi estabelecido como um modelo celular para a compreensão de diversos mecanismos biológicos, assim como no estudo de doenças neuro-degenerativas. Nomeadamente, o estudo dos processos de fosforilação e agregação da αSyn, assim como a pato-biologia desta proteína são passíveis de ser estudados neste organismo, uma vez que em levedura foi previamente demonstrado que a expressão da αSyn humana induz a formação de inclusões citoplasmáticas e confere toxicidade às células, de forma semelhante ao que ocorre não só noutros modelos biológicos, como ratinho e linhas celulares de mamífero, como também nos cérebros de pacientes com DP. Adicionalmente, a utilização deste organismo confere várias vantagens, como o a sua facilidade de manipulação, o curto tempo de geração, o genoma estar sequenciado e devidamente anotado em bases de dados e ser facilmente manipulável geneticamente. Assim, utilizando a levedura como modelo celular, este projeto teve como objetivos abordar a pato-biologia da αSyn em ambas as vertentes esporádica e familiar da DP, nomeadamente A) na caracterização fenotípica da mais recentemente mutação identificada como associada a DP familiar, a mutação da αSyn A53E e B) o estudo da interação da fosforilação entre os resíduos S87 e S129. Para atingir os objetivos propostos, o fenótipo da mutação A53E foi caracterizado recorrendo à avaliação da viabilidade celular, formação de inclusões, expressão e fosforilação da αSyn, solubilidade dos agregados de αSyn e avaliação das alterações da rede mitocondrial. O efeito da fosforilação nos resíduos S129 e S87 foi estudado utilizando estirpes de levedura com o gene que codifica a proteína αSyn humana integrado no genoma, usando diferentes versões mutadas da αSyn, nomeadamente, mutantes que mimetizam e bloqueiam a fosforilação no resíduo S129, os mutantes S129D e S129A, respetivamente, o mutante que mimetiza a fosforilação no resíduo S87 (S87E) e um duplo mutante que mimetiza a simultânea fosforilação no resíduo S87 e S129 (S87E_S129D). Para este grupo de fosfo-mutantes foram avaliados os parâmetros de viabilidade celular, formação de inclusões, expressão, fosforilação e remoção intracelular da αSyn e a função dos mecanismos de manutenção da qualidade celular (função proteossomal e autofágica). Resultante desta análise, foi observado que a expressão da proteína mutante A53E αSyn não resulta em diferenças significativas no fenótipo dos parâmetros avaliados, quando comparado com a expressão da proteína nativa (WT). De facto, a expressão da mutação A53E induz toxicidade e formação de inclusões, mas de forma equivalente à proteína WT, embora com tendência para diminuir o número de inclusões e ainda, relativamente à natureza das inclusões, a solubilidade das inclusões aparenta ser semelhante à proteína WT. Estes resultados estão em parte em concordância com estudos in vitro realizados, que descrevem um fenótipo da A53E de toxicidade celular semelhante à proteína WT. Relativamente ao estudo da interação da fosforilação entre os resíduos S87 e S129, foi observado que quando a fosforilação no resíduo S87 é mimetizada (mutante S87E), a formação de inclusões e toxicidade conferidas pela αSyn aumentam significativamente (aproximadamente 80% de células com inclusões), causando a perda de função proteossomal e ativando a autofagia, quando comparando com a expressão da proteína WT. Surpreendentemente, quando a mutação S87E foi acoplada à mutação que mimetiza a fosforilação no resíduo S129 (mutante S87E_S129D), o fenótipo de toxicidade induzindo pelo mutante S87E é inexistente, prevalecendo um suposto efeito protetor da fosforilação no resíduo S129 (mutante S129D). Adicionalmente, é possível observar que o mutante S87E_S129D tem menos formação de inclusões e apresenta menos toxicidade que a expressão da proteína WT, o que permite inferir que não só prevalece o efeito protetor da mutação S129D sobre o efeito tóxico da mutação S87E, como também poderá existir um efeito sinérgico neuro-protetor quando ambos os resíduos se encontram fosforilados simultaneamente. Explorar os mecanismos específicos com outros organelos assim como os eventos iniciais da agregação, nomeadamente aquando da presença de mutações familiares, é crucial para a determinação de como a αSyn induz toxicidade celular no caso da forma familiar de DP. Em relação ao papel da fosforilação na patogénese de PD, o presente estudo evidencia a importância do estudo de padrões de ativação/desativação de diferentes resíduos. Embora o presente trabalho suporte a ideia de um papel neuro-protetor da fosforilação do resíduo S129 da αSyn, assim como quando esta fosforilação é acoplada à fosforilação no resíduo S87, outras abordagens relativamente a outros padrões de MPTs e outros resíduos de fosforilação, como os restantes resíduos de tirosina, assim como o efeito destes padrões em organelos celulares específicos devem ser seguidos no futuro. As contribuições do presente trabalho, assim como um esforço futuro para a compreensão do efeito de alterações da αSyn no seu comportamento e na proteostase celular, são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégicas terapêuticas, no contexto da DP e de outras synucleinopatias.