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Characterization and expression of subtilases involved in grapevine resistance to Plasmopara viticola

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A videira (Vitis vinifera L.) é a planta de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. A sua área de cultivo mundial atinge os 7,5 milhões de hectares com uma produção de 75,8 milhões de toneladas em 2016, sendo a União Europeia líder na produção mundial de vinho (OIV, 2017). Atualmente, uma das grandes ameaças para a indústria vinícola é o míldio da videira, doença causada pelo oomycete obrigatório Plasmopara viticola que afeta todas as castas de Vitis vinifera frequentemente usadas na produção de vinho. No seu ciclo de vida, o P. viticola hiberna sob a forma de oósporos, estas estruturas são altamente resistentes às condições climáticas adversas, podendo conservar a sua vitalidade durante 2 anos. Sob condições adequadas (temperatura entre os 22-25ºC e humidade elevada) os oósporos germinam, dando origem a zoosporângios que libertam zoósporos que germinam e penetram através dos estomas. Na página superior da folha surgem manchas translúcidas e oleosas coincidentes com o aparecimento de um enfeltrado de micélio branco na página inferior levando ao aparecimento de infeções secundárias. Se não forem utilizadas medidas de controlo apropriadas esta doença pode levar a perdas avultadas durante a época de cultivo. Atualmente, as estratégias de controlo da doença assentam exclusivamente na aplicação preventiva de fitoquímicos durante a época de cultivo, acarretando problemas ambientais graves. O conhecimento profundo dos mecanismos de resistência das plantas resistentes a infeção por Plasmopara vitícola é importante para definir métodos alternativos de controlo. Em estudos anteriores a interação entre a videira e o P. viticola foi caracterizada por uma abordagem de biologia de sistemas. Uma análise detalhada das diferenças entre a resposta de genótipos suscetíveis (interação compatível) e resistentes (interação incompatível) a este patogénio, ao nível da transcritómica, metabolómica e proteómica, permitiu a identificação de mecanismos e de candidatos associados ao estabelecimento da interação incompatível. Um dos candidatos é uma subtilisin-like protein, também denominada subtilase. As subtilases são proteases serínicas que exercem funções altamente específicas no desenvolvimento das plantas e em cascatas de sinalização. Na década passada, vários estudos realçaram o papel das subtilases na resposta de defesa a agentes patogénicos nomeadamente no reconhecimeno dos efetores dos patogénios, sinalização e ativação de uma resposta imunitária da planta. Apesar do mecanismo de acção das subtilases associadas à resposta de defensa contra patogénios não estar ainda elucidado, estudos recentes em plantas modelo como a Arabidopsis e o tomate identificaram a prosistemina (o precursor da sistemina) como o substrato das subtilases durante a ataque por herbívoros e/ou por patógenos. A sistemina é um polipeptídeo com 18 resíduos de aminoácidos ativo presente em concentração muito baixas, que actua na via sinalizadora octadecanóide responsável pela biossíntese do ácido jasmónico (JA). O JA é uma fitohormona vegetal associada a mecanismos de resposta a stress biótico, nomeadamente por patógenios necrotróficos ou herbivoria. Muito recentemente, estudos do nosso grupo de investigação demonstraram o envolvimento do JA na resposta da videira ao patogénio biotrófico Plasmopara viticola. A sistemina, como substrato das subtilases foi inicialmente isolada das folhas de tomate Lycopersicum esculentum Mill., sendo demonstrado que quando uma folha é ferida por herbivoria ou mecanicamente, os genes codificadores de sistemina são expressos, transcritos e rapidamente transportados via floema para outras partes da planta ainda intactas. A sistemina atua sobre cinases proteicas activadas por mitogénio, levando à ativação de fosfolipases e consequente libertação do ácido linoléico das membranas plastidiais. O ácido linoléico é utilizado na síntese do JA que regula, via feedback positivo, a expressão génica da prosistemina. O ácido jasmónico produzido move-se através do sistema vascular onde alcança folhas intactas, desencadeando o processo de defesa. Em estudos anteriores, a família de subtilases de videira foi caracterizada e candidatos putativamente associados à resposta de defesa da videira à infeção com o Plasmopara viticola foram identificados. Com o presente trabalho pretende-se validar o envolvimento desses candidatos na resposta de defesa da videira ao P.viticola, avaliar a sua relação com a elicitação por fitohormonas (JA e ácido salicílico (SA)), e selecionar um candidato para validação funcional. A expressão de 5 genes que codificam as subtilases VviSBT3.19 Isoforma X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoforma X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoforma X1, previamente identificadas como candidatos associados à resistência da videira ao P. viticola foi avaliada por Reação de Polimerização em cadeia em tempo real (qPCR). A sua expressão foi avaliada em dois genótipos de videira, suscetível e resistente ao P. viticola, após inoculação com o patogénio e elicitação com JA e SA. A expressão das subtilases VviSBT5.3a e VviSBT4.19 é aumentada nas primeiras horas (6h), tanto após inoculação como também após elicitação por JA no genótipo resistente, sugerindo o seu envolvimento na resposta imunitária da videira ligada à sinalização por JA. O gene VviSBT4.19 foi selecionado para uma caracterização molecular e funcional de forma a elucidar a sua estrutura e função na resistência da videira ao P. vitícola. A região codificante do gene VviSBT4.19 foi amplificada usando oligonucleótidos específicos para a mesmo. Posteriormente foi efectuada a clonagem da região codificante desta subtilase num vetor de propagação (pJET1.2/blunt) e subsequentemente no vetor de expressão (pET28a(+)). A clonagem e a expressão foram feitas em bactérias adequadas para cada etapa nomeadamente, E. coli TOP10 para clonagem, E. coli BL21codão+ e Turner para expressão. A produção da proteína recombinante foi feita pela adição de β-D-1-tiogalactopiranosideo isopropílico (IPTG). Na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), não foi possível observar nenhuma banda correspondente à massa molecular da proteína de interesse para a abordagem de indução de expressão aplicada. Para confirmar se o não aparecimento da banda da proteína de interesse no gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio era devido a baixa expressão ou ausência da mesma, a expressão da proteína recombinante foi analisada por dot blot, uma técnica análoga a western blot, utilizando anticorpos anti-caudas de histidina, porque a proteína de interesse estava em fusão com resíduos de histidina na região N-terminal. Duas das cinco bactérias Turner induzidas por adição de IPTG foram reconhecidas pelos anticorpos. A determinação da estrutura desta subtilase é fundamental para a compreensão da sua importância e função na resistência da videira ao P. viticola. No momento, estamos a tentar otimizar as condições de expressão e do western blot para ultrapassar os problemas ligados a produção da proteína recombinante e interacção entre a mesma e anticorpos, para poder prosseguir com a purificação da mesma, identificação através da espectrofotometria de massa e posterior estudo da atividade enzimática. Se estes problemas de expressão persistirem vamos seguir uma nova abordagem de expressão que consistirá no uso de vetores eucariotas específicos para expressão e sistemas de expressão eucariotas que foram anteriormente descritas para expressão de subtilases de plantas nomeadamente, células de insetos, usadas na expressão da subtilase de tomate LeSBT1 e sistemas de cultura em suspensão usada na expressão da outra subtilase de tomate denominada LeSBT3. Estes sistemas são mais adequados para a expressão de subtilisinas quando comparados aos vetores ou sistemas de origem procariotas.
Autores principais:	Silva, Clemente da
Assunto:	Vitis vinifera L. Plasmopara vitícola Míldio Inoculação Elicitação expressão VciSBT4.19 isoforma I. Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A videira (Vitis vinifera L.) é a planta de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. A sua área de cultivo mundial atinge os 7,5 milhões de hectares com uma produção de 75,8 milhões de toneladas em 2016, sendo a União Europeia líder na produção mundial de vinho (OIV, 2017). Atualmente, uma das grandes ameaças para a indústria vinícola é o míldio da videira, doença causada pelo oomycete obrigatório Plasmopara viticola que afeta todas as castas de Vitis vinifera frequentemente usadas na produção de vinho. No seu ciclo de vida, o P. viticola hiberna sob a forma de oósporos, estas estruturas são altamente resistentes às condições climáticas adversas, podendo conservar a sua vitalidade durante 2 anos. Sob condições adequadas (temperatura entre os 22-25ºC e humidade elevada) os oósporos germinam, dando origem a zoosporângios que libertam zoósporos que germinam e penetram através dos estomas. Na página superior da folha surgem manchas translúcidas e oleosas coincidentes com o aparecimento de um enfeltrado de micélio branco na página inferior levando ao aparecimento de infeções secundárias. Se não forem utilizadas medidas de controlo apropriadas esta doença pode levar a perdas avultadas durante a época de cultivo. Atualmente, as estratégias de controlo da doença assentam exclusivamente na aplicação preventiva de fitoquímicos durante a época de cultivo, acarretando problemas ambientais graves. O conhecimento profundo dos mecanismos de resistência das plantas resistentes a infeção por Plasmopara vitícola é importante para definir métodos alternativos de controlo. Em estudos anteriores a interação entre a videira e o P. viticola foi caracterizada por uma abordagem de biologia de sistemas. Uma análise detalhada das diferenças entre a resposta de genótipos suscetíveis (interação compatível) e resistentes (interação incompatível) a este patogénio, ao nível da transcritómica, metabolómica e proteómica, permitiu a identificação de mecanismos e de candidatos associados ao estabelecimento da interação incompatível. Um dos candidatos é uma subtilisin-like protein, também denominada subtilase. As subtilases são proteases serínicas que exercem funções altamente específicas no desenvolvimento das plantas e em cascatas de sinalização. Na década passada, vários estudos realçaram o papel das subtilases na resposta de defesa a agentes patogénicos nomeadamente no reconhecimeno dos efetores dos patogénios, sinalização e ativação de uma resposta imunitária da planta. Apesar do mecanismo de acção das subtilases associadas à resposta de defensa contra patogénios não estar ainda elucidado, estudos recentes em plantas modelo como a Arabidopsis e o tomate identificaram a prosistemina (o precursor da sistemina) como o substrato das subtilases durante a ataque por herbívoros e/ou por patógenos. A sistemina é um polipeptídeo com 18 resíduos de aminoácidos ativo presente em concentração muito baixas, que actua na via sinalizadora octadecanóide responsável pela biossíntese do ácido jasmónico (JA). O JA é uma fitohormona vegetal associada a mecanismos de resposta a stress biótico, nomeadamente por patógenios necrotróficos ou herbivoria. Muito recentemente, estudos do nosso grupo de investigação demonstraram o envolvimento do JA na resposta da videira ao patogénio biotrófico Plasmopara viticola. A sistemina, como substrato das subtilases foi inicialmente isolada das folhas de tomate Lycopersicum esculentum Mill., sendo demonstrado que quando uma folha é ferida por herbivoria ou mecanicamente, os genes codificadores de sistemina são expressos, transcritos e rapidamente transportados via floema para outras partes da planta ainda intactas. A sistemina atua sobre cinases proteicas activadas por mitogénio, levando à ativação de fosfolipases e consequente libertação do ácido linoléico das membranas plastidiais. O ácido linoléico é utilizado na síntese do JA que regula, via feedback positivo, a expressão génica da prosistemina. O ácido jasmónico produzido move-se através do sistema vascular onde alcança folhas intactas, desencadeando o processo de defesa. Em estudos anteriores, a família de subtilases de videira foi caracterizada e candidatos putativamente associados à resposta de defesa da videira à infeção com o Plasmopara viticola foram identificados. Com o presente trabalho pretende-se validar o envolvimento desses candidatos na resposta de defesa da videira ao P.viticola, avaliar a sua relação com a elicitação por fitohormonas (JA e ácido salicílico (SA)), e selecionar um candidato para validação funcional. A expressão de 5 genes que codificam as subtilases VviSBT3.19 Isoforma X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoforma X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoforma X1, previamente identificadas como candidatos associados à resistência da videira ao P. viticola foi avaliada por Reação de Polimerização em cadeia em tempo real (qPCR). A sua expressão foi avaliada em dois genótipos de videira, suscetível e resistente ao P. viticola, após inoculação com o patogénio e elicitação com JA e SA. A expressão das subtilases VviSBT5.3a e VviSBT4.19 é aumentada nas primeiras horas (6h), tanto após inoculação como também após elicitação por JA no genótipo resistente, sugerindo o seu envolvimento na resposta imunitária da videira ligada à sinalização por JA. O gene VviSBT4.19 foi selecionado para uma caracterização molecular e funcional de forma a elucidar a sua estrutura e função na resistência da videira ao P. vitícola. A região codificante do gene VviSBT4.19 foi amplificada usando oligonucleótidos específicos para a mesmo. Posteriormente foi efectuada a clonagem da região codificante desta subtilase num vetor de propagação (pJET1.2/blunt) e subsequentemente no vetor de expressão (pET28a(+)). A clonagem e a expressão foram feitas em bactérias adequadas para cada etapa nomeadamente, E. coli TOP10 para clonagem, E. coli BL21codão+ e Turner para expressão. A produção da proteína recombinante foi feita pela adição de β-D-1-tiogalactopiranosideo isopropílico (IPTG). Na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), não foi possível observar nenhuma banda correspondente à massa molecular da proteína de interesse para a abordagem de indução de expressão aplicada. Para confirmar se o não aparecimento da banda da proteína de interesse no gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio era devido a baixa expressão ou ausência da mesma, a expressão da proteína recombinante foi analisada por dot blot, uma técnica análoga a western blot, utilizando anticorpos anti-caudas de histidina, porque a proteína de interesse estava em fusão com resíduos de histidina na região N-terminal. Duas das cinco bactérias Turner induzidas por adição de IPTG foram reconhecidas pelos anticorpos. A determinação da estrutura desta subtilase é fundamental para a compreensão da sua importância e função na resistência da videira ao P. viticola. No momento, estamos a tentar otimizar as condições de expressão e do western blot para ultrapassar os problemas ligados a produção da proteína recombinante e interacção entre a mesma e anticorpos, para poder prosseguir com a purificação da mesma, identificação através da espectrofotometria de massa e posterior estudo da atividade enzimática. Se estes problemas de expressão persistirem vamos seguir uma nova abordagem de expressão que consistirá no uso de vetores eucariotas específicos para expressão e sistemas de expressão eucariotas que foram anteriormente descritas para expressão de subtilases de plantas nomeadamente, células de insetos, usadas na expressão da subtilase de tomate LeSBT1 e sistemas de cultura em suspensão usada na expressão da outra subtilase de tomate denominada LeSBT3. Estes sistemas são mais adequados para a expressão de subtilisinas quando comparados aos vetores ou sistemas de origem procariotas.