Publicação

Efeito da administração de enzimossomas de superóxido dismutase na lesão de reperfusão do fígado: estudos num modelo animal de isquémia/reperfusão

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A lesão de isquémia/reperfusão do fígado ocorre em inúmeros contextos clínicos, nomeadamente em transplantes, e apresenta taxas significativas de morbilidade e mortalidade. A formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e a subsequente reoxigenação do fígado danificam os tecidos e iniciam cascatas celular que conduzem a uma resposta inflamatória aguda, morte celular e, em última instância, à insuficiência e falha do órgão. Vários investigadores têm desenhado tratamentos com alta potencialidade, baseados na remoção das ROS através da administração de enzimas antioxidantes, tais como o superóxido dismutase (SOD). Este enzima apresenta um perfil farmacocinético pouco favorável, uma vez que ao ser administrado apresenta um curto tempo de vida no plasma (6 a 12 minutos) e uma rápida remoção renal via filtração glomerular. Uma forma de contornar estes problemas é promover a sua associação a um sistema de transporte - os lipossomas- capaz de manter a estrutura e atividade proteica, alterando a sua farmacocinética e entregando-as ao tecido alvo de forma segura, e conseguindo melhorar a eficácia de fármacos proteicos. Nos enzimossomas de SOD utilizados neste trabalho, o enzima terapêutico encontra-se ligado covalentemente à superfície exterior da bicamada do lipossoma, a qual está revestida com PEG. Foi comparada a sua eficácia terapêutica quer com o enzima na forma solúvel quer encapsulado no espaço interno aquoso de lipossomas de longo tempo de circulação (igualmente revestido com PEG). Neste estudo observou-se que a eficácia de incorporação da proteína na vesícula lipídica varia de lipossomas para enzimossomas, sendo que nesta última formulação o fato de a proteína se encontrar ligada covalentemente à bicamada lipídica, através de um lípido modificado (Maleimida-PEG-PE), aumenta este parâmetro de 9 para 25%. O método de preparação é um fator que condiciona a eficácia de encapsulação/conjugação da proteína à vesícula lipídica. Assim, para os lipossomas recorreu-se ao mátodo de desidratação-rehidratação (DRV) que ajuda a aumentar a eficácia de encapsulação do SOD nos lipossomas. Contudo, o processo de extrusão diminui a eficácia de encapsulação do SOD, uma vez que durante a extrusão os lipossomas rompem e o SOD tem tendência a escapar do espaço interno aquoso para a fase externa. Na preparação de enzimossomas, o método escolhido foi o MLV (suspensão de um filme lipídico numa solução aquosa), obtendo-se vesículas multilamelares. Quanto ao tamanho das vesículas, o seu dimensionamento foi realizado através do processo de extrusão usando filtros de porosidade adequada. No entanto, neste caso este processo não é crítico para a retenção de enzima dado que a associação deste é feita posteriormente. Desta forma, e sabendo que o tamanho é um fator determinante no sucesso de entrega do fármaco ao seu local alvo, obtiveram-se partículas com diametro médio 0,15 µm para ambas as formulações, condição ideal para que atinjam os locais de inflamação originados pela situação de I/R hepática. Foram ainda otimizados vários procedimentos experimentais como a cirurgia de indução da isquémia/reperfusão bem como os tempos de isquémia e posterior recolha de amostras de sangue e de fígado. Assim, optou-se por se realizar os estudos in vivo em animais com isquémia induzida durante 30 minutos, e posterior sacrifício para recolha das amostras de sangue e fígado, 24 horas após a cirurgia. A recolha de amostras de sangue permitiu uma análise bioquímica, nomeadamente a atividade de vários enzimas hepáticos (aspartato transaminase, alanina transaminase, fosfatase alcalino e ƴ-glutamiltransferase) que deveriam apresentar níveis de atividade semelhantes aos animais controlo, após tratamento, ou seja, após administração de SOD. A atividade do aspartato transaminase foi a que mais alterou com a isquémia e com a administração das formulações. Quanto à inversão leucocitária e à análise patológica foram ambas inconclusivas. Os extratos proteicos hepáticos correspondentes quer à fração nuclear, quer à fração citosólica, foram analisados por SDS-PAGE seguido de western-blot, de modo a quantificar os níveis de NF- ҡB e IҡBα. Este ponto de estudo foi também ele inconclusivo, uma vez que não se observaram diferenças significativas nos níveis de ativação de NF- ҡB e IҡBα. Para isso será necessário efectuar no futuro a análise de mais extratos proteicos. Igualmente importante para se ter um melhor retrato do processo de isquémica/reperfusão no fígado e da sua terapêutica será o uso de diferentes tempos de isquémia e de recolha das amostras de fígado.
Autores principais:	Fontes, Filipa Sobreira Pires Salavessa
Assunto:	Isquémia/reperfusão Superóxido dismutase (SOD) Enzimossomas Teses de mestrado - 2012
Ano:	2012
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A lesão de isquémia/reperfusão do fígado ocorre em inúmeros contextos clínicos, nomeadamente em transplantes, e apresenta taxas significativas de morbilidade e mortalidade. A formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e a subsequente reoxigenação do fígado danificam os tecidos e iniciam cascatas celular que conduzem a uma resposta inflamatória aguda, morte celular e, em última instância, à insuficiência e falha do órgão. Vários investigadores têm desenhado tratamentos com alta potencialidade, baseados na remoção das ROS através da administração de enzimas antioxidantes, tais como o superóxido dismutase (SOD). Este enzima apresenta um perfil farmacocinético pouco favorável, uma vez que ao ser administrado apresenta um curto tempo de vida no plasma (6 a 12 minutos) e uma rápida remoção renal via filtração glomerular. Uma forma de contornar estes problemas é promover a sua associação a um sistema de transporte - os lipossomas- capaz de manter a estrutura e atividade proteica, alterando a sua farmacocinética e entregando-as ao tecido alvo de forma segura, e conseguindo melhorar a eficácia de fármacos proteicos. Nos enzimossomas de SOD utilizados neste trabalho, o enzima terapêutico encontra-se ligado covalentemente à superfície exterior da bicamada do lipossoma, a qual está revestida com PEG. Foi comparada a sua eficácia terapêutica quer com o enzima na forma solúvel quer encapsulado no espaço interno aquoso de lipossomas de longo tempo de circulação (igualmente revestido com PEG). Neste estudo observou-se que a eficácia de incorporação da proteína na vesícula lipídica varia de lipossomas para enzimossomas, sendo que nesta última formulação o fato de a proteína se encontrar ligada covalentemente à bicamada lipídica, através de um lípido modificado (Maleimida-PEG-PE), aumenta este parâmetro de 9 para 25%. O método de preparação é um fator que condiciona a eficácia de encapsulação/conjugação da proteína à vesícula lipídica. Assim, para os lipossomas recorreu-se ao mátodo de desidratação-rehidratação (DRV) que ajuda a aumentar a eficácia de encapsulação do SOD nos lipossomas. Contudo, o processo de extrusão diminui a eficácia de encapsulação do SOD, uma vez que durante a extrusão os lipossomas rompem e o SOD tem tendência a escapar do espaço interno aquoso para a fase externa. Na preparação de enzimossomas, o método escolhido foi o MLV (suspensão de um filme lipídico numa solução aquosa), obtendo-se vesículas multilamelares. Quanto ao tamanho das vesículas, o seu dimensionamento foi realizado através do processo de extrusão usando filtros de porosidade adequada. No entanto, neste caso este processo não é crítico para a retenção de enzima dado que a associação deste é feita posteriormente. Desta forma, e sabendo que o tamanho é um fator determinante no sucesso de entrega do fármaco ao seu local alvo, obtiveram-se partículas com diametro médio 0,15 µm para ambas as formulações, condição ideal para que atinjam os locais de inflamação originados pela situação de I/R hepática. Foram ainda otimizados vários procedimentos experimentais como a cirurgia de indução da isquémia/reperfusão bem como os tempos de isquémia e posterior recolha de amostras de sangue e de fígado. Assim, optou-se por se realizar os estudos in vivo em animais com isquémia induzida durante 30 minutos, e posterior sacrifício para recolha das amostras de sangue e fígado, 24 horas após a cirurgia. A recolha de amostras de sangue permitiu uma análise bioquímica, nomeadamente a atividade de vários enzimas hepáticos (aspartato transaminase, alanina transaminase, fosfatase alcalino e ƴ-glutamiltransferase) que deveriam apresentar níveis de atividade semelhantes aos animais controlo, após tratamento, ou seja, após administração de SOD. A atividade do aspartato transaminase foi a que mais alterou com a isquémia e com a administração das formulações. Quanto à inversão leucocitária e à análise patológica foram ambas inconclusivas. Os extratos proteicos hepáticos correspondentes quer à fração nuclear, quer à fração citosólica, foram analisados por SDS-PAGE seguido de western-blot, de modo a quantificar os níveis de NF- ҡB e IҡBα. Este ponto de estudo foi também ele inconclusivo, uma vez que não se observaram diferenças significativas nos níveis de ativação de NF- ҡB e IҡBα. Para isso será necessário efectuar no futuro a análise de mais extratos proteicos. Igualmente importante para se ter um melhor retrato do processo de isquémica/reperfusão no fígado e da sua terapêutica será o uso de diferentes tempos de isquémia e de recolha das amostras de fígado.