Publicação
Factores de transcrição artificiais na identificação de genes celulares importantes na infecciosidade do HIV-1
| Resumo: | Apesar dos notáveis avanços observados no tratamento da infecção por HIV-1 não foi ainda alcançada a total eliminação do vírus do organismo humano. Existem já estirpes de HIV-1 resistentes à terapia anti-retroviral actual e, persistem ainda problemas inerentes à sua toxicidade, efeitos secundários e elevado custo. Perante o actual panorama, é de extrema importância a descoberta de potenciais novos alvos farmacológicos que possibilitem o desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Este trabalho teve como objectivo a identificação de novos genes celulares importantes para a infecciosidade do HIV-1, tendo em vista o desenvolvimento de novos tratamentos contra a infecção. Para tal, utilizaram-se 3 bibliotecas de factores de transcrição sintéticos com domínios de ligação ao DNA com motivos de zinc-fingers (TFZF), fundidos com o activador transcricional VP64. As bibliotecas foram usadas para transduzir células Jurkat, de forma a obter clones capazes de expressar os TFZF de forma estável. Estes clones foram infectados com HIV-1 NL4-3 para avaliar a sua resistência ao vírus. Neste primeiro screening, as células transduzidas com a biblioteca 5FG revelaram-se inviáveis, e não foi possível isolar clones da biblioteca 5FG/A. Foram seleccionados 13 clones da biblioteca 5FA, tendo-se verificado que, num deles a produção de vírus foi consideravelmente inferior à de células controlo (clone resistente), e nos restantes 12 foi consideravelmente superior. Foi confirmada a presença de um TFZF integrado no genoma de todos os clones, tendo este sido isolado e sequenciado. A análise das sequências resultantes revelou a presença do mesmo TFZF em todos os clones, capaz de reconhecer uma sequência específica de DNA. Utilizando ferramentas bioinformáticas, foi possível revelar os vários locais do genoma humano onde o TFZF se poderia ligar, tendo sido identificados 137 novos genes potencialmente envolvidos no ciclo replicativo viral. O trabalho aqui descrito constituiu uma primeira abordagem à identificação de genes celulares importantes no ciclo do HIV-1 através de uma nova metodologia, baseada na modulação da expressão génica usando factores de transcrição artificiais. Os resultados preliminares obtidos constituem uma base importante para estudos futuros, sendo mais um passo na tentativa de clarificar a complexa relação entre o HIV-1 e o seu hospedeiro. |
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| Autores principais: | Pinto, Joana Borges Soares Ataíde |
| Assunto: | Genética microbiana HIV-1 Expressão genética Teses de mestrado |
| Ano: | 2009 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | português |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | Apesar dos notáveis avanços observados no tratamento da infecção por HIV-1 não foi ainda alcançada a total eliminação do vírus do organismo humano. Existem já estirpes de HIV-1 resistentes à terapia anti-retroviral actual e, persistem ainda problemas inerentes à sua toxicidade, efeitos secundários e elevado custo. Perante o actual panorama, é de extrema importância a descoberta de potenciais novos alvos farmacológicos que possibilitem o desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Este trabalho teve como objectivo a identificação de novos genes celulares importantes para a infecciosidade do HIV-1, tendo em vista o desenvolvimento de novos tratamentos contra a infecção. Para tal, utilizaram-se 3 bibliotecas de factores de transcrição sintéticos com domínios de ligação ao DNA com motivos de zinc-fingers (TFZF), fundidos com o activador transcricional VP64. As bibliotecas foram usadas para transduzir células Jurkat, de forma a obter clones capazes de expressar os TFZF de forma estável. Estes clones foram infectados com HIV-1 NL4-3 para avaliar a sua resistência ao vírus. Neste primeiro screening, as células transduzidas com a biblioteca 5FG revelaram-se inviáveis, e não foi possível isolar clones da biblioteca 5FG/A. Foram seleccionados 13 clones da biblioteca 5FA, tendo-se verificado que, num deles a produção de vírus foi consideravelmente inferior à de células controlo (clone resistente), e nos restantes 12 foi consideravelmente superior. Foi confirmada a presença de um TFZF integrado no genoma de todos os clones, tendo este sido isolado e sequenciado. A análise das sequências resultantes revelou a presença do mesmo TFZF em todos os clones, capaz de reconhecer uma sequência específica de DNA. Utilizando ferramentas bioinformáticas, foi possível revelar os vários locais do genoma humano onde o TFZF se poderia ligar, tendo sido identificados 137 novos genes potencialmente envolvidos no ciclo replicativo viral. O trabalho aqui descrito constituiu uma primeira abordagem à identificação de genes celulares importantes no ciclo do HIV-1 através de uma nova metodologia, baseada na modulação da expressão génica usando factores de transcrição artificiais. Os resultados preliminares obtidos constituem uma base importante para estudos futuros, sendo mais um passo na tentativa de clarificar a complexa relação entre o HIV-1 e o seu hospedeiro. |
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