Publicação

Implementação de uma metodologia para análise metagenómica do microbioma humano em amostras com baixa biomassa de microrganismos

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O corpo humano é colonizado por um grande conjunto de microrganismos que vivem em simbiose com o homem. Desta colonização fazem parte bactérias, fungos, vírus e protozoários, que se espalham ao longo das superfícies externas e internas do corpo, criando microbiomas com características e funções específicas. Os estudos do microbioma vieram beneficiar de forma significativa dos avanços das novas tecnologias de sequenciação ("next-generation sequencing"), as quais permitem sequenciar elevadas quantidades de DNA a um custo muito reduzido. No entanto, este tipo de estudos também acarreta algumas dificuldades, nomeadamente a presença de uma pequena biomassa de microrganismos em alguns locais do corpo e a contaminação com estirpes ambientais durante a colheita e processamento das amostras. Neste trabalho foi implementada uma metodologia para analise de contaminantes em amostras com baixa biomassa. Para este objectivo, foi extraído DNA genómico de 34 amostras de tecido renal tumoral em 9 séries de extração, tendo sido incluído 1 controlo branco em cada procedimento de extracção. Os DNAs foram amplificados por nested PCR para a região V3 e V4 do gene 16S rRNA, tendo sido incluído um controlo negativo da PCR por cada conjunto de amostras amplificadas. Os amplicões do gene 16S rRNA compreenderam um total de 96 amostras e controlos, incluindo duplicados que foram sequenciados em plataforma Illumina, tendo-se obtido um total de 47.3 milhões de reads. Estas reads foram tratadas e processadas usando a plataforma bioinformática QIIME2. Após a filtragem e o denoising das reads, a análise taxonómica revelou a presença de 19 filos, 27 classes, 55ordens, 75 famílias, 89 géneros e 114 espécies distintas em amostras e controlos. Usando o pacote Decontam do R, foram identificados 35 géneros contaminantes nos controlos da extracção e 17 géneros contaminantes foram identificados nos controlos da PCR. A proporção de contaminantes nas amostras de DNA variou entre 0,01% e 24,8%. Entre estes, foram detectados 9 géneros que não estão normalmente presentes como contaminantes em estudos de metagenómica, pelo que a sua detecção neste estudo permitirá analisar com cautela os resultados de futuras amostras com estes géneros. Uma vez que a maioria dos géneros contaminantes foi detectada nos controlos da extracção, deve ser dada especial atenção à pureza e manipulação dos reagentes utilizados na preparação das amostras. Dos géneros contaminantes detectados, 9 não foram referidos em outros estudos como contaminantes, indicando que a presença destes microorganismos em estudos de microbioma futuros, devem ser interpretados com precaução. Concluímos que as estirpes contaminantes são um problema sério em estudos de microbioma, em amostras com baixa biomassa e que a metodologia apresentada aqui é uma abordagem eficiente para detectar e quantificar essas estirpes contaminantes.
Autores principais:	Durão, Dina Isabel Filipe Carpinteiro
Assunto:	Sequenciação de próxima-geração bioinformática metagenómica gene 16S rRNA contaminantes Teses de mestrado - 2020
Ano:	2020
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O corpo humano é colonizado por um grande conjunto de microrganismos que vivem em simbiose com o homem. Desta colonização fazem parte bactérias, fungos, vírus e protozoários, que se espalham ao longo das superfícies externas e internas do corpo, criando microbiomas com características e funções específicas. Os estudos do microbioma vieram beneficiar de forma significativa dos avanços das novas tecnologias de sequenciação ("next-generation sequencing"), as quais permitem sequenciar elevadas quantidades de DNA a um custo muito reduzido. No entanto, este tipo de estudos também acarreta algumas dificuldades, nomeadamente a presença de uma pequena biomassa de microrganismos em alguns locais do corpo e a contaminação com estirpes ambientais durante a colheita e processamento das amostras. Neste trabalho foi implementada uma metodologia para analise de contaminantes em amostras com baixa biomassa. Para este objectivo, foi extraído DNA genómico de 34 amostras de tecido renal tumoral em 9 séries de extração, tendo sido incluído 1 controlo branco em cada procedimento de extracção. Os DNAs foram amplificados por nested PCR para a região V3 e V4 do gene 16S rRNA, tendo sido incluído um controlo negativo da PCR por cada conjunto de amostras amplificadas. Os amplicões do gene 16S rRNA compreenderam um total de 96 amostras e controlos, incluindo duplicados que foram sequenciados em plataforma Illumina, tendo-se obtido um total de 47.3 milhões de reads. Estas reads foram tratadas e processadas usando a plataforma bioinformática QIIME2. Após a filtragem e o denoising das reads, a análise taxonómica revelou a presença de 19 filos, 27 classes, 55ordens, 75 famílias, 89 géneros e 114 espécies distintas em amostras e controlos. Usando o pacote Decontam do R, foram identificados 35 géneros contaminantes nos controlos da extracção e 17 géneros contaminantes foram identificados nos controlos da PCR. A proporção de contaminantes nas amostras de DNA variou entre 0,01% e 24,8%. Entre estes, foram detectados 9 géneros que não estão normalmente presentes como contaminantes em estudos de metagenómica, pelo que a sua detecção neste estudo permitirá analisar com cautela os resultados de futuras amostras com estes géneros. Uma vez que a maioria dos géneros contaminantes foi detectada nos controlos da extracção, deve ser dada especial atenção à pureza e manipulação dos reagentes utilizados na preparação das amostras. Dos géneros contaminantes detectados, 9 não foram referidos em outros estudos como contaminantes, indicando que a presença destes microorganismos em estudos de microbioma futuros, devem ser interpretados com precaução. Concluímos que as estirpes contaminantes são um problema sério em estudos de microbioma, em amostras com baixa biomassa e que a metodologia apresentada aqui é uma abordagem eficiente para detectar e quantificar essas estirpes contaminantes.