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The study of the reprogramming of metabolism of Trincadeira grapes upon infection with Botrytis cinerea

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As uvas (espécie Vitis) são, a nível económico, o fruto mais importante à escala mundial. No entanto, as videiras são suscetíveis a várias doenças, sendo que os fungos são a principal causa para a redução de qualidade em uvas e do seu respetivo rendimento. A Trincadeira é uma variedade de videira muito importante em Portugal, pois dá origem a excelentes vinhos em alguns anos. No entanto, é também extremamente suscetível a doenças derivadas de fungos como o bolor cinzento causado por Botrytis cinerea, que é uma das doenças mais perigosas para as uvas. Esta tese de mestrado tem como objetivo aumentar o conhecimento relativo à forma como o metabolismo das uvas, bem como a qualidade do vinho, é afetado pela infeção com B. cinerea, complementando estudos recentes. A iniciação dos mecanismos de defesa contra patógenos necrotróficos, biotróficos e hemibiotróficos está já bem documentada no estudo de tecidos vegetativos, enquanto outros órgãos como os frutos (neste caso, a uva) ainda não foram bem estudados nesse aspeto. Aquando a infeção, o metabolismo hormonal das uvas é reprogramado graças ao envolvimento putativo de jasmonatos, ácido abcísico, auxinas e outras fito-hormonas, ao passo que o ácido salicílico não aparenta estar envolvido neste processo. Como tal, estamos interessados em estudar a forma como o metabolismo hormonal é regulado em uvas infetadas com B. cinerea, especialmente tendo em conta o papel desempenhado por estas hormonas tanto no amadurecimento do fruto como na resposta a stress biótico. Com este trabalho, temos como objetivo revelar nova informação relativamente às respostas das uvas durante interações patógeno-hospedeiro. Isto será feito através de uma análise combinada de perfis metabólicos de bagos infetados com análise da expressão de alguns genes envolvidos no metabolismo de hormonas. Pretendemos comparar as mudanças observadas no metabolismo hormonal aquando infeção com B. cinerea entre uma variedade suscetível (Trincadeira) e uma variedade resistente (Syrah). Por outro lado, o estudo da forma de como o aroma das uvas é influenciado por este tipo de infeção (em particular, o estudo do metabolismo de terpenos), e quais as consequências na qualidade do vinho são aspetos importantes neste contexto. De modo a conseguir estes resultados, bagos de uva controlo e infetados em três estágios de amadurecimento (green, EL32; veraison, EL35; harvest, EL38) foram colhidos para podermos efetuar quantificação de hormonas, análise de expressão de genes envolvidos no metabolismo hormonal e identificação de voláteis. Para fazer a análise de voláteis, foram usadas amostras liofilizadas a -40ºC. No entanto, foi concluído que, através do uso desta abordagem, muito poucos compostos conseguem ser detetados no processo e que uma grande quantidade inicial de material é necessária, de preferência proveniente de amostras frescas. Relativamente ao metabolismo de hormonas, os resultados obtidos mostram que os jasmonatos (OPDA e JA-Ile) estão envolvidos na resposta das uvas contra stress biótico proveniente da infeção. Estas hormonas já tinham sido caracterizadas como estando envolvidas no amadurecimento através do crescimento e do desenvolvimento de coloração dos bagos. Estudos prévios indicam que os jasmonatos são também responsáveis pela regulação de respostas de defesa como respostas contra stress oxidativo e stress por dessecação. Neste caso, as uvas da variedade Syrah apresentaram um elevado conteúdo basal de jasmonatos, ao passo que as uvas da variedade Trincadeira apresentaram um grande aumento na concentração de JA-Ile após estarem infetadas. As mudanças observadas na expressão dos genes envolvidos na biossíntese de JA-Ile (genes que codificam para as proteínas allene oxide synthase e 12-oxophytodienoate reductase 1) apoiam este aumento observado na quantidade de jasmonatos, já que uma baixa expressão destes genes a nível basal significa que não são necessários nas primeiras fases de crescimento devido ao já elevado conteúdo em jasmonatos. O metabolismo relativamente ao ácido abcísico apoia o já conhecido papel desta hormona no amadurecimento. É sabido de estudos anteriores que o ácido abcísico tem um papel importante no amadurecimento das uvas, sendo responsável por processos importantes na acumulação de açúcares e aumento da coloração dos bagos. Estes dados foram apoiados pelo aumento de ABA que observámos durante o início do amadurecimento. Para além do amadurecimento, os resultados que obtivémos sugeriram ainda que esta hormona possa estar também envolvida na defesa das uvas contra a infeção por Botrytis cinerea. Esta observação advém do facto de que o teor em ácido abcísico tende a aumentar após a infeção e de que se verificou uma maior expressão dos genes envolvidos na síntese e na sinalização desta hormona (genes que codificam para a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase e para o ABA receptor PYL4 RCAR10, respetivamente). No entanto, observou-se também um conteúdo basal em ABA baixo na variedade Syrah, que é resistente contra a infeção. Como tal, futuras investigações terão de ser feitas relativamente ao papel do ácido abcísico aquando a infeção. Relativamente ao papel das auxinas, sabe-se que estas hormonas estão presentes em baixas concentrações no início do amadurecimento, pois níveis elevados de auxinas atrasam a acumulação de açúcares que é essencial nesta fase. Estes dados estão de acordo com os resultados que obtivemos relativamente à expressão génica. No que toca ao seu papel na defesa, foram observados níveis basais elevados em uvas da variedade Syrah (que podem sugerir a existência de uma resposta acelerada quando infetadas) e aumentos de concentração em uvas da variedade Trincadeira após estas serem infetadas. Ambos estes fatores podem ser interpretados como indicadores de que as auxinas estão envolvidas na resposta das uvas contra o patógeno. Foram ainda observadas mudanças na expressão de genes envolvidos na síntese, sinalização e transporte de auxinas (genes que codificam para a IAA-amido synthetase e para o auxin-responsive SAUR29), em especial durante o início do amadurecimento. Estas mudanças sugeriram que as auxinas têm um papel importante tanto no crescimento como no amadurecimento das uvas. No que toca à importância do ácido salicílico, esta hormona tinha sido, devido a estudos anteriores, associada apenas à resposta contra fungos biotróficos. Estudos prévios estudaram o seu envolvimento na resposta contra fungos necrotróficos e foi colocada a hipótese de que, aquando a infeção, um fungo como Botrytis cinerea ativa alguns dos mecanismos de defesa da uva mas inibe as vias relacionadas com o ácido salicílico. No entanto, ao contrário do sugerido, também aparenta estar envolvida na resposta à infeção por fungos deste tipo, devido aos resultados obtidos em que a variedade de vinha resistente apresentou um alto conteúdo basal de ácido salicílico, o que pode significar uma resposta rápida contra a infeção. A expressão de genes envolvidos na sinalização mediada por ácido salicílico (genes que codificam para a proteína enhanced disease susceptibility 1 e para o seu co-regulador, phytoalexine deficient 4) mostrou ter uma progressão que, inicialmente, apoiava estes resultados. No entanto, foi observado que esta expressão decresceu em uvas da variedade Syrah durante os primeiros estágios de crescimento, o que não está de acordo com os resultados obtidos pela quantificação de hormonas. Desta forma, serão precisos estudos mais desenvolvidos no que toca ao papel do ácido salicílico na defesa contra patógenos necrotróficos. Em conclusão, este trabalho permitiu efetuar uma análise de um modo mais detalhado do papel desempenhado por algumas fito-hormonas tanto no crescimento e amadurecimento de uvas como na defesa relativamente a stress biótico. Permitiu também a sugestão de mecanismos, tanto moleculares como metabólicos, que podem estar envolvidos na regulação de ambos os processos.
Autores principais:	Coelho, João Miguel da Costa
Assunto:	Botrytis cinerea Videira Metabolismo de hormonas Amadurecimento Resposta ao stress Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As uvas (espécie Vitis) são, a nível económico, o fruto mais importante à escala mundial. No entanto, as videiras são suscetíveis a várias doenças, sendo que os fungos são a principal causa para a redução de qualidade em uvas e do seu respetivo rendimento. A Trincadeira é uma variedade de videira muito importante em Portugal, pois dá origem a excelentes vinhos em alguns anos. No entanto, é também extremamente suscetível a doenças derivadas de fungos como o bolor cinzento causado por Botrytis cinerea, que é uma das doenças mais perigosas para as uvas. Esta tese de mestrado tem como objetivo aumentar o conhecimento relativo à forma como o metabolismo das uvas, bem como a qualidade do vinho, é afetado pela infeção com B. cinerea, complementando estudos recentes. A iniciação dos mecanismos de defesa contra patógenos necrotróficos, biotróficos e hemibiotróficos está já bem documentada no estudo de tecidos vegetativos, enquanto outros órgãos como os frutos (neste caso, a uva) ainda não foram bem estudados nesse aspeto. Aquando a infeção, o metabolismo hormonal das uvas é reprogramado graças ao envolvimento putativo de jasmonatos, ácido abcísico, auxinas e outras fito-hormonas, ao passo que o ácido salicílico não aparenta estar envolvido neste processo. Como tal, estamos interessados em estudar a forma como o metabolismo hormonal é regulado em uvas infetadas com B. cinerea, especialmente tendo em conta o papel desempenhado por estas hormonas tanto no amadurecimento do fruto como na resposta a stress biótico. Com este trabalho, temos como objetivo revelar nova informação relativamente às respostas das uvas durante interações patógeno-hospedeiro. Isto será feito através de uma análise combinada de perfis metabólicos de bagos infetados com análise da expressão de alguns genes envolvidos no metabolismo de hormonas. Pretendemos comparar as mudanças observadas no metabolismo hormonal aquando infeção com B. cinerea entre uma variedade suscetível (Trincadeira) e uma variedade resistente (Syrah). Por outro lado, o estudo da forma de como o aroma das uvas é influenciado por este tipo de infeção (em particular, o estudo do metabolismo de terpenos), e quais as consequências na qualidade do vinho são aspetos importantes neste contexto. De modo a conseguir estes resultados, bagos de uva controlo e infetados em três estágios de amadurecimento (green, EL32; veraison, EL35; harvest, EL38) foram colhidos para podermos efetuar quantificação de hormonas, análise de expressão de genes envolvidos no metabolismo hormonal e identificação de voláteis. Para fazer a análise de voláteis, foram usadas amostras liofilizadas a -40ºC. No entanto, foi concluído que, através do uso desta abordagem, muito poucos compostos conseguem ser detetados no processo e que uma grande quantidade inicial de material é necessária, de preferência proveniente de amostras frescas. Relativamente ao metabolismo de hormonas, os resultados obtidos mostram que os jasmonatos (OPDA e JA-Ile) estão envolvidos na resposta das uvas contra stress biótico proveniente da infeção. Estas hormonas já tinham sido caracterizadas como estando envolvidas no amadurecimento através do crescimento e do desenvolvimento de coloração dos bagos. Estudos prévios indicam que os jasmonatos são também responsáveis pela regulação de respostas de defesa como respostas contra stress oxidativo e stress por dessecação. Neste caso, as uvas da variedade Syrah apresentaram um elevado conteúdo basal de jasmonatos, ao passo que as uvas da variedade Trincadeira apresentaram um grande aumento na concentração de JA-Ile após estarem infetadas. As mudanças observadas na expressão dos genes envolvidos na biossíntese de JA-Ile (genes que codificam para as proteínas allene oxide synthase e 12-oxophytodienoate reductase 1) apoiam este aumento observado na quantidade de jasmonatos, já que uma baixa expressão destes genes a nível basal significa que não são necessários nas primeiras fases de crescimento devido ao já elevado conteúdo em jasmonatos. O metabolismo relativamente ao ácido abcísico apoia o já conhecido papel desta hormona no amadurecimento. É sabido de estudos anteriores que o ácido abcísico tem um papel importante no amadurecimento das uvas, sendo responsável por processos importantes na acumulação de açúcares e aumento da coloração dos bagos. Estes dados foram apoiados pelo aumento de ABA que observámos durante o início do amadurecimento. Para além do amadurecimento, os resultados que obtivémos sugeriram ainda que esta hormona possa estar também envolvida na defesa das uvas contra a infeção por Botrytis cinerea. Esta observação advém do facto de que o teor em ácido abcísico tende a aumentar após a infeção e de que se verificou uma maior expressão dos genes envolvidos na síntese e na sinalização desta hormona (genes que codificam para a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase e para o ABA receptor PYL4 RCAR10, respetivamente). No entanto, observou-se também um conteúdo basal em ABA baixo na variedade Syrah, que é resistente contra a infeção. Como tal, futuras investigações terão de ser feitas relativamente ao papel do ácido abcísico aquando a infeção. Relativamente ao papel das auxinas, sabe-se que estas hormonas estão presentes em baixas concentrações no início do amadurecimento, pois níveis elevados de auxinas atrasam a acumulação de açúcares que é essencial nesta fase. Estes dados estão de acordo com os resultados que obtivemos relativamente à expressão génica. No que toca ao seu papel na defesa, foram observados níveis basais elevados em uvas da variedade Syrah (que podem sugerir a existência de uma resposta acelerada quando infetadas) e aumentos de concentração em uvas da variedade Trincadeira após estas serem infetadas. Ambos estes fatores podem ser interpretados como indicadores de que as auxinas estão envolvidas na resposta das uvas contra o patógeno. Foram ainda observadas mudanças na expressão de genes envolvidos na síntese, sinalização e transporte de auxinas (genes que codificam para a IAA-amido synthetase e para o auxin-responsive SAUR29), em especial durante o início do amadurecimento. Estas mudanças sugeriram que as auxinas têm um papel importante tanto no crescimento como no amadurecimento das uvas. No que toca à importância do ácido salicílico, esta hormona tinha sido, devido a estudos anteriores, associada apenas à resposta contra fungos biotróficos. Estudos prévios estudaram o seu envolvimento na resposta contra fungos necrotróficos e foi colocada a hipótese de que, aquando a infeção, um fungo como Botrytis cinerea ativa alguns dos mecanismos de defesa da uva mas inibe as vias relacionadas com o ácido salicílico. No entanto, ao contrário do sugerido, também aparenta estar envolvida na resposta à infeção por fungos deste tipo, devido aos resultados obtidos em que a variedade de vinha resistente apresentou um alto conteúdo basal de ácido salicílico, o que pode significar uma resposta rápida contra a infeção. A expressão de genes envolvidos na sinalização mediada por ácido salicílico (genes que codificam para a proteína enhanced disease susceptibility 1 e para o seu co-regulador, phytoalexine deficient 4) mostrou ter uma progressão que, inicialmente, apoiava estes resultados. No entanto, foi observado que esta expressão decresceu em uvas da variedade Syrah durante os primeiros estágios de crescimento, o que não está de acordo com os resultados obtidos pela quantificação de hormonas. Desta forma, serão precisos estudos mais desenvolvidos no que toca ao papel do ácido salicílico na defesa contra patógenos necrotróficos. Em conclusão, este trabalho permitiu efetuar uma análise de um modo mais detalhado do papel desempenhado por algumas fito-hormonas tanto no crescimento e amadurecimento de uvas como na defesa relativamente a stress biótico. Permitiu também a sugestão de mecanismos, tanto moleculares como metabólicos, que podem estar envolvidos na regulação de ambos os processos.