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The role of CDKs in co-transcriptional splicing through phosphorylation of the RNA Pol II carboxy-terminal domain (CTD)

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Summary:	O processo de transcrição, no qual uma molécula de ácido ribonucleico (ARN) é produzido a partir de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar a ela, é caracterizado por diversas etapas em que envolvem centenas de proteínas e outros fatores constituídos por RNA. Por esse processo os genes se expressam e assim constituem os componentes celulares e teciduais formadores do organismo, além de darem origem às enzimas, elementos envolvidos nas reações necessárias ao funcionamento dos seres vivos. Ao longo do processo transcricional, o transcrito enquanto é polimerizado também passa por processamentos, os quais modificam a sequência e a constituição do mesmo. Algumas dessas edições podem ocorrer após a transcrição ser finalizada, mas o acoplamento do processamento à transcrição traz vantagens como a diminuição do tempo requerido entre um estímulo parece iniciar a expressão de um gene e o produto final dessa expressão estar pronto e disponível para executar sua função. Nesse sentido, o Domínio carboxi-terminal (do inglês CTD) da ARN polimerase II (Pol II) faz o acoplamento entre o processamento do ARN e a transcrição. O CTD assemelha se a uma cauda que se alonga a partir da maior subunidade da Pol II que não só serve de suporte aos fatores envolvidos na transcrição como também ativamente os recruta devido às modificações pós translacionais aos quais são submetidos os aminoácidos que o constituem. Esse domínio é, na verdade, composto por várias repetições da sequência Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Sabe-se razoavelmente como esses aminoácidos e suas isoformas modificadas, geralmente fosforiladas, influenciam o processo transcricional e o processamento do ARN. No entanto, no que diz respeito ao splicing co-transcricional são poucas as informações a esse respeito. Foi reportado que a maquinaria envolvida no splicing parece estar ligada a Ser5 fosforilada quando Pol II foram imunoprecipitadas com o uso de anticorpos para essa serina e ligada as polimerases foram encontrados 5’ intermediários da primeira reação de transesterificação do splicing. Também foi reportado que em células de Drosophila, ao se fazer uso da técnica de NET-seq observou-se que a polimerase se encontrava a curta distância de onde uma região em que um intron havia sido excisado quando os investigadores fizeram uso de anti-Ser5P. Neste trabalho hipotetizamos que a Ser5 fosforilada contribui para a ocorrência de splicings ainda próximos a Pol II em elongamento. Para testar se de fato a isoforma fosforilada dessa serina desempenha esse papel, decidimos inibir as cinases responsáveis pela fosforilação das mesmas (Cinase Dependentes de Ciclinas, do inglês CDKs) a fim de averiguar se essa inibição causa uma mudança nas dinâmicas do splicing co-transcricional. Primeiramente, selecionamos inibidores farmacológicos desenvolvidos em células humanas para usarmos em células de Drosophila com o intuito de evitar a fosforilação da Ser5 do CTD. Infelizmente, nenhum dos inibidores foi capaz de impedir que a Ser5 fosse fosforilada. Provavelmente, a razão para tal foi a incapacidade dos inibidores de se ligarem ao sítio ativo das cinases. Apesar de tanto as CDKs humanas quanto as de Drosophila apresentarem considerável similaridade na sua sequência de aminoácidos, a pequena diferença de aminoácidos entre as CDKs deve ser suficiente para que os inibidores não consigam se ligar as de Drosophila. Apesar de não ser nosso objetivo, conseguimos prevenir a fosforilação específica da Ser2 em Drosophila quando da inibição da CDK12. Diante do postulado, resolvemos mudar a estratégia e escolhemos o método Auxin-Inducible Degron (AID) para depletar de forma rápida as CDKs. Com esse método adicionamos uma tag a proteína alvo, e quando for conveniente, aplicamos auxina ao meio de cultura para que a mesma possa induzir a proteína à ubiquitinação seguida da degradação da própria. Antes que isso possa ser realizado, é necessário introduzir a tag no local devido dentro do genoma de Drosophila. Para tanto, selecionamos um protocolo desenvolvido para adição de sequências na porção N-terminal de genes de Drosophila utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9. Essa técnica faz uso da extensão sobreposta de primers para produzir um guia curto de 19 nucleotídeos com a sequência correspondente ao local onde se deve criar uma quebra dupla no ADN, e um constructo formado de braços de homologia que flanqueiam a AID tag para servir de molde para o reparo por recombinação homóloga (RH). Em nossa primeira tentativa, apesar de termos conseguido produzir os guias e os constructos de RH para todas as três cinases transcricionais que queremos depletar, CDK7, CDK9 e CDK12, não obtivemos sucesso ao transfectar nossas células. Nos constructos também está incluída uma sequência que promove resistência ao antibiótico Blasticidina e que deveria servir para selecionar apenas as células em que a tag havia sido corretamente inserida no genoma. No entanto, ainda que as células tivessem se mostrado resistentes ao antibiótico, ao analisarmos se houve de fato inserção dos construtos no genoma por PCR, percebemos que as tags não estavam presentes na porção N-terminal das CDKs. Esses resultados nos levam a crer que uma possível inserção dos constructos em locais não específicos dentro do genoma das Drosophilas permitiu que essas células apresentassem resistência. Em uma posterior segunda tentativa, e após termos mudados a linha celular usada (S2 ao invés de DMEL) e termos substituído o agente de transfecção por FuGENE® HD, conseguimos inserir a AID-tag na porção desejada da CDK9. Por não termos tido mais tempo para inserir a tag nas demais CDKs, não foi possível estimular a degradação das mesmas pela indução com auxina. A fim de que possamos utilizar o método Degron futuramente para depletar as CDKs, alguns aspectos do método precisam ser revistos e melhorados. Visto que as células apresentaram resistência ao antibiótico Blasticidina apesar de o constructo não ter sido inserido no local desejado, isso nos leva a crer que talvez tenha havido uma inserção em outro lugar do genoma devido a falha em impedir a ocorrência de união de extremidades não homólogas (NHEJ em inglês). Uma solução possível pode ser aumentar a concentração de lig4 e mus308. Entretanto, enquanto ainda estávamos tentando inibir ou depletar as cinases transcricionais, repetidamente preparamos livrarias obtidas a partir do procedimento de NET-seq. Com essa técnica é possível detectar o transcrito nascente ainda acoplado a Pol II e sequenciá-lo com alta resolução os nucleotídeos nele presentes. Os protocolos disponíveis sobre a versão dessa técnica que faz uso de anticorpos para diversos perfis de fosforilação do CTD foram descritos para células de mamíferos (mNET-seq) ou embriões de Drosophila (dNET-seq). Apesar de similar em alguns pontos, o protocolo usado para essa dissertação teve de ser adaptado para células de Drosophila em cultura (DMEL). Para tanto, fizemos ensaios para testar a melhor concentração e tempo de digestão da enzima MNase. Também testamos diferentes concentrações de anticorpo e avaliamos a quantidade de beads necessária para a imunoprecipitação de Pol II. Tínhamos predito para esse trabalho a partir do uso do NET-seq, perceber mudanças nas pausas típicas para a Pol II downstream da 3’ SS como também alterações nas dinâmicas de splicing ao impedir a fosforilação de Ser5. No entanto, apesar de termos focado em uma possível correlação entre a ser5P e splicing, a técnica de Degron combinada ao NET-seq pode vir a ser utilizada para estudar o envolvimento de diversos fatores e o comportamento do Pol II CTD durante outros processos co-transcricionais como corte e adição da cauda poli(A). Portanto, acreditamos que a junção dessas duas técnicas pode vir a ser bastante útil no descobrimento de relações ainda pouco exploradas no que diz respeito às modificações pós-traducionais do CTD e a formação e edição do transcrito nascente.
Main Authors:	Cunha, Thais Souza
Subject:	Splicing Pol II CTD Cyclin-dependent kinases dNET-seq Teses de mestrado - 2021
Year:	2021
Country:	Portugal
Document type:	master thesis
Access type:	open access
Associated institution:	Universidade de Lisboa
Language:	English
Origin:	Repositório da Universidade de Lisboa

Description
Summary:	O processo de transcrição, no qual uma molécula de ácido ribonucleico (ARN) é produzido a partir de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar a ela, é caracterizado por diversas etapas em que envolvem centenas de proteínas e outros fatores constituídos por RNA. Por esse processo os genes se expressam e assim constituem os componentes celulares e teciduais formadores do organismo, além de darem origem às enzimas, elementos envolvidos nas reações necessárias ao funcionamento dos seres vivos. Ao longo do processo transcricional, o transcrito enquanto é polimerizado também passa por processamentos, os quais modificam a sequência e a constituição do mesmo. Algumas dessas edições podem ocorrer após a transcrição ser finalizada, mas o acoplamento do processamento à transcrição traz vantagens como a diminuição do tempo requerido entre um estímulo parece iniciar a expressão de um gene e o produto final dessa expressão estar pronto e disponível para executar sua função. Nesse sentido, o Domínio carboxi-terminal (do inglês CTD) da ARN polimerase II (Pol II) faz o acoplamento entre o processamento do ARN e a transcrição. O CTD assemelha se a uma cauda que se alonga a partir da maior subunidade da Pol II que não só serve de suporte aos fatores envolvidos na transcrição como também ativamente os recruta devido às modificações pós translacionais aos quais são submetidos os aminoácidos que o constituem. Esse domínio é, na verdade, composto por várias repetições da sequência Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Sabe-se razoavelmente como esses aminoácidos e suas isoformas modificadas, geralmente fosforiladas, influenciam o processo transcricional e o processamento do ARN. No entanto, no que diz respeito ao splicing co-transcricional são poucas as informações a esse respeito. Foi reportado que a maquinaria envolvida no splicing parece estar ligada a Ser5 fosforilada quando Pol II foram imunoprecipitadas com o uso de anticorpos para essa serina e ligada as polimerases foram encontrados 5’ intermediários da primeira reação de transesterificação do splicing. Também foi reportado que em células de Drosophila, ao se fazer uso da técnica de NET-seq observou-se que a polimerase se encontrava a curta distância de onde uma região em que um intron havia sido excisado quando os investigadores fizeram uso de anti-Ser5P. Neste trabalho hipotetizamos que a Ser5 fosforilada contribui para a ocorrência de splicings ainda próximos a Pol II em elongamento. Para testar se de fato a isoforma fosforilada dessa serina desempenha esse papel, decidimos inibir as cinases responsáveis pela fosforilação das mesmas (Cinase Dependentes de Ciclinas, do inglês CDKs) a fim de averiguar se essa inibição causa uma mudança nas dinâmicas do splicing co-transcricional. Primeiramente, selecionamos inibidores farmacológicos desenvolvidos em células humanas para usarmos em células de Drosophila com o intuito de evitar a fosforilação da Ser5 do CTD. Infelizmente, nenhum dos inibidores foi capaz de impedir que a Ser5 fosse fosforilada. Provavelmente, a razão para tal foi a incapacidade dos inibidores de se ligarem ao sítio ativo das cinases. Apesar de tanto as CDKs humanas quanto as de Drosophila apresentarem considerável similaridade na sua sequência de aminoácidos, a pequena diferença de aminoácidos entre as CDKs deve ser suficiente para que os inibidores não consigam se ligar as de Drosophila. Apesar de não ser nosso objetivo, conseguimos prevenir a fosforilação específica da Ser2 em Drosophila quando da inibição da CDK12. Diante do postulado, resolvemos mudar a estratégia e escolhemos o método Auxin-Inducible Degron (AID) para depletar de forma rápida as CDKs. Com esse método adicionamos uma tag a proteína alvo, e quando for conveniente, aplicamos auxina ao meio de cultura para que a mesma possa induzir a proteína à ubiquitinação seguida da degradação da própria. Antes que isso possa ser realizado, é necessário introduzir a tag no local devido dentro do genoma de Drosophila. Para tanto, selecionamos um protocolo desenvolvido para adição de sequências na porção N-terminal de genes de Drosophila utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9. Essa técnica faz uso da extensão sobreposta de primers para produzir um guia curto de 19 nucleotídeos com a sequência correspondente ao local onde se deve criar uma quebra dupla no ADN, e um constructo formado de braços de homologia que flanqueiam a AID tag para servir de molde para o reparo por recombinação homóloga (RH). Em nossa primeira tentativa, apesar de termos conseguido produzir os guias e os constructos de RH para todas as três cinases transcricionais que queremos depletar, CDK7, CDK9 e CDK12, não obtivemos sucesso ao transfectar nossas células. Nos constructos também está incluída uma sequência que promove resistência ao antibiótico Blasticidina e que deveria servir para selecionar apenas as células em que a tag havia sido corretamente inserida no genoma. No entanto, ainda que as células tivessem se mostrado resistentes ao antibiótico, ao analisarmos se houve de fato inserção dos construtos no genoma por PCR, percebemos que as tags não estavam presentes na porção N-terminal das CDKs. Esses resultados nos levam a crer que uma possível inserção dos constructos em locais não específicos dentro do genoma das Drosophilas permitiu que essas células apresentassem resistência. Em uma posterior segunda tentativa, e após termos mudados a linha celular usada (S2 ao invés de DMEL) e termos substituído o agente de transfecção por FuGENE® HD, conseguimos inserir a AID-tag na porção desejada da CDK9. Por não termos tido mais tempo para inserir a tag nas demais CDKs, não foi possível estimular a degradação das mesmas pela indução com auxina. A fim de que possamos utilizar o método Degron futuramente para depletar as CDKs, alguns aspectos do método precisam ser revistos e melhorados. Visto que as células apresentaram resistência ao antibiótico Blasticidina apesar de o constructo não ter sido inserido no local desejado, isso nos leva a crer que talvez tenha havido uma inserção em outro lugar do genoma devido a falha em impedir a ocorrência de união de extremidades não homólogas (NHEJ em inglês). Uma solução possível pode ser aumentar a concentração de lig4 e mus308. Entretanto, enquanto ainda estávamos tentando inibir ou depletar as cinases transcricionais, repetidamente preparamos livrarias obtidas a partir do procedimento de NET-seq. Com essa técnica é possível detectar o transcrito nascente ainda acoplado a Pol II e sequenciá-lo com alta resolução os nucleotídeos nele presentes. Os protocolos disponíveis sobre a versão dessa técnica que faz uso de anticorpos para diversos perfis de fosforilação do CTD foram descritos para células de mamíferos (mNET-seq) ou embriões de Drosophila (dNET-seq). Apesar de similar em alguns pontos, o protocolo usado para essa dissertação teve de ser adaptado para células de Drosophila em cultura (DMEL). Para tanto, fizemos ensaios para testar a melhor concentração e tempo de digestão da enzima MNase. Também testamos diferentes concentrações de anticorpo e avaliamos a quantidade de beads necessária para a imunoprecipitação de Pol II. Tínhamos predito para esse trabalho a partir do uso do NET-seq, perceber mudanças nas pausas típicas para a Pol II downstream da 3’ SS como também alterações nas dinâmicas de splicing ao impedir a fosforilação de Ser5. No entanto, apesar de termos focado em uma possível correlação entre a ser5P e splicing, a técnica de Degron combinada ao NET-seq pode vir a ser utilizada para estudar o envolvimento de diversos fatores e o comportamento do Pol II CTD durante outros processos co-transcricionais como corte e adição da cauda poli(A). Portanto, acreditamos que a junção dessas duas técnicas pode vir a ser bastante útil no descobrimento de relações ainda pouco exploradas no que diz respeito às modificações pós-traducionais do CTD e a formação e edição do transcrito nascente.