Publicação

The role of ABC proteins in the mechanism of action of promising ruthenium anticancer agents

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O cancro é um termo genérico para um vasto grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do nosso corpo. Esta doença é definida pela proliferação anormal de células. Estas células anómalas podem invadir outros tecidos e órgãos formando assim metástases. O cancro, considerado uma doença mundial e que afeta diversas faixas etárias, continua a ser uma preocupação para a população e, nomeadamente, para os cientistas. A investigação nesta área já é longa e felizmente conta já com importantes avanços. No entanto, apesar de todos os progressos, continuam a existir obstáculos para o tratamento cem por cento eficaz. Um desses obstáculos é a resistência das células cancerígenas aos fármacos, o que limita consideravelmente a eficácia dos mesmos. Esta resistência deve-se a vários fatores sendo, um deles, a existência de um tipo de proteínas transportadoras, denominadas transportadores ABC, que se encontram sobre expressas nas células cancerígenas e que atuam sobre os fármacos levando ao seu rápido efluxo para fora da célula limitando, assim, a sua capacidade de ação sobre as células cancerígenas. A resistência a fármacos refere-se à capacidade das células cancerígenas para resistirem a uma variedade estrutural de fármacos anticancerígenos, levando a um dos maiores problemas da quimioterapia. Na realidade, este tipo de resistência é responsável pelo fracasso de mais de 90 % dos tratamentos em cancro. A família ABC (ATP binding cassette) é constituída por várias proteínas, sendo que atualmente as mais conhecidas, e aqui estudadas são: P-gp ou ABCB1, MRP1 ou ABCC1, MRP2 ou ABCC2 e ABCG2 ou BCRP. Apesar de existirem várias teorias que procuram explicar os seus mecanismos de ação, a certeza é que estas proteínas transportadoras permitem a expulsão dos fármacos, aumentando, em consequência, a resistências das células cancerígenas a estes fármacos. Os estudos de elucidação dos mecanismos bioquímicos que permitem combater esta resistência aos fármacos têm-se centrado principalmente na identificação de inibidores seletivos destas proteínas que bloqueiem a passagem dos fármacos para o exterior da célula cancerígena. A maior limitação até agora tem sido encontrar inibidores específicos para cada transportador, que ao mesmo tempo apresentem baixa citotoxicidade para células saudáveis e de alta eficiência. Por isso, a investigação nesta área continua a ser uma prioridade. Foi neste âmbito que o Laboratorio de Química Organometálica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal, juntamente com o “Drug Resistance and Membrane Proteins team” em Lyon, França, avaliou, durante a realização desta tese de Mestrado, o papel que diversos transportadores ABC têm no mecanismo de ação de uma família de complexos organometálicos de ruténio ciclopentadienilo, “RuCp” (Cp = η5-C5H5). Foram estudados sete compostos, todos contendo o fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’, com potencial atividade anticancerígena e anteriormente desenvolvidos pelo Laboratório de Química Organometálica. Entre eles, encontram-se os compostos de ruténio-polímero PMC78 e PMC85 que foram escolhidos devido ao seu elevado peso molecular que permite uma maior facilidade de acumulação destes compostos no interior das células pelo efeito de EPR (“enhanced permeation and retention effect”). Para além disso, estes compostos revelaram melhores citotoxicidades que a cisplatina para as linhas celulares do ovário A2780 e mama MCF7 e MDA-MB-231, e parecem ser capazes de ultrapassar os mecanismos de resistência de células cancerígenas (resultados obtidos por comparação entre a linha celular A2780 sensível e A2780CisR, resistente à cisplatina) . Para além destes compostos, foi também escolhido o composto PMC79, composto parental dos anteriores, com a mesma estrutura, mas sem as cadeias de polímero na sua estrutura. O composto PMC79 apresenta uma boa citotoxicidade relativamente à cisplatina para as mesmas linhas celulares. No entanto, para este composto o nível de acumulação nas células A2780 sensíveis foi muito superior que nas resistentes. Devido a estes resultados, o PMC79 foi também escolhido para este trabalho para se tentar perceber em maior detalhe qual o(s) transportadores ABC responsáveis por este efeito. O composto LCR134, [Ru(η5-Cp)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3], foi também escolhido uma vez que é baseado no PMC79, mas onde foram adicionadas duas moléculas de biotina (vitamina H ou B7) à bipiridina. A inclusão desta biomolécula poderá ser vantajosa devido à capacidade de se ligar a recetores da membrana celular das células cancerígenas. A biotina é essencial para o nosso organismo e tem sido frequentemente utilizada em diversos estudos reportando a sua facilidade de transporte para dentro das células cancerígenas. Os três compostos restantes, pertencem à subfamília de ruténio η5-metilciclopentadienilo e foram escolhidos com o objetivo de se conseguir obter uma correlação entre a sua atividade biológica e os substituintes na bipiridina. Desta forma, para se estudar o papel dos transportadores ABC no mecanismo de ação destes compostos, utilizaram-se diversas técnicas, tais como o teste de viabilidade celular para avaliar a citotoxicidade de cada composto através do cálculo do IC50, citometria de fluxo para verificar a percentagem de inibição de cada composto para os transportadores ABC, citometria de massa para quantificar a percentagem de acumulação do ruténio nas células, e docking molecular para a caracterizar a ligação de compostos ao sitio ativo da proteína P-gp. Todos os compostos obtiveram bons resultados ao nível da citotoxicidade para a linha celular cancerígena 2008C (1.1 - 4.5 μM), assim como bons níveis de internalização celular de ruténio. Os resultados obtidos permitiram concluir que compostos mesmo estruturalmente muito similares, possuem atividades biológicas distintas. Verificou-se que os compostos de ruténio-polímero, PMC78 e PMC85, são mais citotóxicos para células sobre expressas com transportadores (P-gp e MRP1, respetivamente) do que sem transportadores. O PMC78 demonstrou também que seria um bom inibidor para a P-gp. Todos estes fatores levaram a indicar que o uso do polilactídeo poderá potenciar a ação anticancerígena de compostos não poliméricos. Observou-se também que o uso do fragmento da bipiridina funcionalizada com duas moléculas de biotina poderá potenciar a capacidade anticancerígena dos compostos, visto que o complexo LCR134 revelou ser muito bom inibidor da P-gp. Cálculos de docking molecular mostram que é possível que haja competição entre o LCR134 e o conhecido substrato Rodamina 123 pelo centro ativo da P-gp . Os compostos LCR136 e RT11, pertencentes à família η5-MeCp, foram os compostos que revelaram os melhores resultados ao nível das suas atividades inibidoras e a melhor internalização para as linhas com os transportadores ABC estudados, sugerindo uma correlação entre as suas atividades e a sua internalização celular. Para além disso, revelaram melhor citotoxicidade para células sobre expressas. Os compostos PMC79 e RT12, são os compostos estruturalmente mais parecidos, onde a única diferença é a existência do grupo metil no ciclopentadienilo para o RT12. Os resultados mostraram que estes dois compostos têm atividades biológicas muito parecidas. Ambos são mais citotóxicos para as células sem sobre expressão de transportadores do que para as células sobre expressas e parecem não terem qualquer efeito inibitório para este tipo de células resistentes, contrariamente aos outros compostos estudados. Concluindo, pode-se afirmar que o grupo -CH2OH, comum aos dois compostos e que os distingue dos restantes, terá um papel importante no efluxo dos mesmos, tornando-os substratos dos transportadores ABC. Decorrente da avaliação dos estudos biológicos realizados, foi sintetizado com sucesso um novo complexo de ruténio, [Ru(η5-(Me-C5H4)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3] (Ru2). Este composto foi analisado por técnicas espetroscópicas como o RMN (1H, 31P, 13C e técnicas bidimensionais), UV-Vis e FT-IR, e a sua pureza foi determinada por análises elementares. O complexo revelou também adequada estabilidade em meio celular (variação menor que 5 % às 24 h) e caráter lipofílico (logPo/w= 1,6), o que nos assegurou continuação para os estudos biológicos neste novo composto. Foi então avaliado, para Ru2, a viabilidade celular nas linhas celulares utilizadas anteriormente. Contrariamente aos resultados previamente obtidos, este novo complexo de ruténio é muito menos citotóxico para NIH3T3 WT, NIH3T3-P-gp e 2008C, sendo que não é citotóxico para as outras linhas celulares estudadas. Percebe-se também que este composto é um substrato para a P-gp e não tem qualquer efeito inibitório para esta ou outra proteína transportadora. Concluindo, pode-se afirmar que a coordenação da biotina e do grupo η5-MeCp na mesma estrutura parece modificar a capacidade inibitória para P-gp e MRP2 como tinham os compostos LCR134, RT11 e LCR136. Este resultado revelou ser muito interessante, e como tal deve ser explorado em trabalhos futuros. Deste modo este trabalho apresenta pela primeira vez o estudo de novos compostos de ruténio com fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ em células sobre expressas por transportadores ABC. A descoberta de que estes complexos de ruténio são inibidores para proteínas transportadoras abre novas possibilidades relativamente aos seus mecanismos de ação. Para além disso, tal como observado para outros compostos da literatura, verificou-se que pequenas alterações estruturais desencadeiam respostas biológicas muito diferentes mostrando a importância deste tipo de estudos que relaciona a estrutura com a atividade. O objetivo deste trabalho foi então concluído com sucesso revelando que compostos de ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ poderão constituir uma ferramenta importante para o combate ao cancro, especialmente em cancros resistentes.
Autores principais:	Gírio, Patrícia Alexandra Madeira
Assunto:	Transportadores ABC Resistência a fármacos Compostos organometálicos Complexos de ruténio ciclopentadienilo Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O cancro é um termo genérico para um vasto grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do nosso corpo. Esta doença é definida pela proliferação anormal de células. Estas células anómalas podem invadir outros tecidos e órgãos formando assim metástases. O cancro, considerado uma doença mundial e que afeta diversas faixas etárias, continua a ser uma preocupação para a população e, nomeadamente, para os cientistas. A investigação nesta área já é longa e felizmente conta já com importantes avanços. No entanto, apesar de todos os progressos, continuam a existir obstáculos para o tratamento cem por cento eficaz. Um desses obstáculos é a resistência das células cancerígenas aos fármacos, o que limita consideravelmente a eficácia dos mesmos. Esta resistência deve-se a vários fatores sendo, um deles, a existência de um tipo de proteínas transportadoras, denominadas transportadores ABC, que se encontram sobre expressas nas células cancerígenas e que atuam sobre os fármacos levando ao seu rápido efluxo para fora da célula limitando, assim, a sua capacidade de ação sobre as células cancerígenas. A resistência a fármacos refere-se à capacidade das células cancerígenas para resistirem a uma variedade estrutural de fármacos anticancerígenos, levando a um dos maiores problemas da quimioterapia. Na realidade, este tipo de resistência é responsável pelo fracasso de mais de 90 % dos tratamentos em cancro. A família ABC (ATP binding cassette) é constituída por várias proteínas, sendo que atualmente as mais conhecidas, e aqui estudadas são: P-gp ou ABCB1, MRP1 ou ABCC1, MRP2 ou ABCC2 e ABCG2 ou BCRP. Apesar de existirem várias teorias que procuram explicar os seus mecanismos de ação, a certeza é que estas proteínas transportadoras permitem a expulsão dos fármacos, aumentando, em consequência, a resistências das células cancerígenas a estes fármacos. Os estudos de elucidação dos mecanismos bioquímicos que permitem combater esta resistência aos fármacos têm-se centrado principalmente na identificação de inibidores seletivos destas proteínas que bloqueiem a passagem dos fármacos para o exterior da célula cancerígena. A maior limitação até agora tem sido encontrar inibidores específicos para cada transportador, que ao mesmo tempo apresentem baixa citotoxicidade para células saudáveis e de alta eficiência. Por isso, a investigação nesta área continua a ser uma prioridade. Foi neste âmbito que o Laboratorio de Química Organometálica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal, juntamente com o “Drug Resistance and Membrane Proteins team” em Lyon, França, avaliou, durante a realização desta tese de Mestrado, o papel que diversos transportadores ABC têm no mecanismo de ação de uma família de complexos organometálicos de ruténio ciclopentadienilo, “RuCp” (Cp = η5-C5H5). Foram estudados sete compostos, todos contendo o fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’, com potencial atividade anticancerígena e anteriormente desenvolvidos pelo Laboratório de Química Organometálica. Entre eles, encontram-se os compostos de ruténio-polímero PMC78 e PMC85 que foram escolhidos devido ao seu elevado peso molecular que permite uma maior facilidade de acumulação destes compostos no interior das células pelo efeito de EPR (“enhanced permeation and retention effect”). Para além disso, estes compostos revelaram melhores citotoxicidades que a cisplatina para as linhas celulares do ovário A2780 e mama MCF7 e MDA-MB-231, e parecem ser capazes de ultrapassar os mecanismos de resistência de células cancerígenas (resultados obtidos por comparação entre a linha celular A2780 sensível e A2780CisR, resistente à cisplatina) . Para além destes compostos, foi também escolhido o composto PMC79, composto parental dos anteriores, com a mesma estrutura, mas sem as cadeias de polímero na sua estrutura. O composto PMC79 apresenta uma boa citotoxicidade relativamente à cisplatina para as mesmas linhas celulares. No entanto, para este composto o nível de acumulação nas células A2780 sensíveis foi muito superior que nas resistentes. Devido a estes resultados, o PMC79 foi também escolhido para este trabalho para se tentar perceber em maior detalhe qual o(s) transportadores ABC responsáveis por este efeito. O composto LCR134, [Ru(η5-Cp)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3], foi também escolhido uma vez que é baseado no PMC79, mas onde foram adicionadas duas moléculas de biotina (vitamina H ou B7) à bipiridina. A inclusão desta biomolécula poderá ser vantajosa devido à capacidade de se ligar a recetores da membrana celular das células cancerígenas. A biotina é essencial para o nosso organismo e tem sido frequentemente utilizada em diversos estudos reportando a sua facilidade de transporte para dentro das células cancerígenas. Os três compostos restantes, pertencem à subfamília de ruténio η5-metilciclopentadienilo e foram escolhidos com o objetivo de se conseguir obter uma correlação entre a sua atividade biológica e os substituintes na bipiridina. Desta forma, para se estudar o papel dos transportadores ABC no mecanismo de ação destes compostos, utilizaram-se diversas técnicas, tais como o teste de viabilidade celular para avaliar a citotoxicidade de cada composto através do cálculo do IC50, citometria de fluxo para verificar a percentagem de inibição de cada composto para os transportadores ABC, citometria de massa para quantificar a percentagem de acumulação do ruténio nas células, e docking molecular para a caracterizar a ligação de compostos ao sitio ativo da proteína P-gp. Todos os compostos obtiveram bons resultados ao nível da citotoxicidade para a linha celular cancerígena 2008C (1.1 - 4.5 μM), assim como bons níveis de internalização celular de ruténio. Os resultados obtidos permitiram concluir que compostos mesmo estruturalmente muito similares, possuem atividades biológicas distintas. Verificou-se que os compostos de ruténio-polímero, PMC78 e PMC85, são mais citotóxicos para células sobre expressas com transportadores (P-gp e MRP1, respetivamente) do que sem transportadores. O PMC78 demonstrou também que seria um bom inibidor para a P-gp. Todos estes fatores levaram a indicar que o uso do polilactídeo poderá potenciar a ação anticancerígena de compostos não poliméricos. Observou-se também que o uso do fragmento da bipiridina funcionalizada com duas moléculas de biotina poderá potenciar a capacidade anticancerígena dos compostos, visto que o complexo LCR134 revelou ser muito bom inibidor da P-gp. Cálculos de docking molecular mostram que é possível que haja competição entre o LCR134 e o conhecido substrato Rodamina 123 pelo centro ativo da P-gp . Os compostos LCR136 e RT11, pertencentes à família η5-MeCp, foram os compostos que revelaram os melhores resultados ao nível das suas atividades inibidoras e a melhor internalização para as linhas com os transportadores ABC estudados, sugerindo uma correlação entre as suas atividades e a sua internalização celular. Para além disso, revelaram melhor citotoxicidade para células sobre expressas. Os compostos PMC79 e RT12, são os compostos estruturalmente mais parecidos, onde a única diferença é a existência do grupo metil no ciclopentadienilo para o RT12. Os resultados mostraram que estes dois compostos têm atividades biológicas muito parecidas. Ambos são mais citotóxicos para as células sem sobre expressão de transportadores do que para as células sobre expressas e parecem não terem qualquer efeito inibitório para este tipo de células resistentes, contrariamente aos outros compostos estudados. Concluindo, pode-se afirmar que o grupo -CH2OH, comum aos dois compostos e que os distingue dos restantes, terá um papel importante no efluxo dos mesmos, tornando-os substratos dos transportadores ABC. Decorrente da avaliação dos estudos biológicos realizados, foi sintetizado com sucesso um novo complexo de ruténio, [Ru(η5-(Me-C5H4)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3] (Ru2). Este composto foi analisado por técnicas espetroscópicas como o RMN (1H, 31P, 13C e técnicas bidimensionais), UV-Vis e FT-IR, e a sua pureza foi determinada por análises elementares. O complexo revelou também adequada estabilidade em meio celular (variação menor que 5 % às 24 h) e caráter lipofílico (logPo/w= 1,6), o que nos assegurou continuação para os estudos biológicos neste novo composto. Foi então avaliado, para Ru2, a viabilidade celular nas linhas celulares utilizadas anteriormente. Contrariamente aos resultados previamente obtidos, este novo complexo de ruténio é muito menos citotóxico para NIH3T3 WT, NIH3T3-P-gp e 2008C, sendo que não é citotóxico para as outras linhas celulares estudadas. Percebe-se também que este composto é um substrato para a P-gp e não tem qualquer efeito inibitório para esta ou outra proteína transportadora. Concluindo, pode-se afirmar que a coordenação da biotina e do grupo η5-MeCp na mesma estrutura parece modificar a capacidade inibitória para P-gp e MRP2 como tinham os compostos LCR134, RT11 e LCR136. Este resultado revelou ser muito interessante, e como tal deve ser explorado em trabalhos futuros. Deste modo este trabalho apresenta pela primeira vez o estudo de novos compostos de ruténio com fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ em células sobre expressas por transportadores ABC. A descoberta de que estes complexos de ruténio são inibidores para proteínas transportadoras abre novas possibilidades relativamente aos seus mecanismos de ação. Para além disso, tal como observado para outros compostos da literatura, verificou-se que pequenas alterações estruturais desencadeiam respostas biológicas muito diferentes mostrando a importância deste tipo de estudos que relaciona a estrutura com a atividade. O objetivo deste trabalho foi então concluído com sucesso revelando que compostos de ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ poderão constituir uma ferramenta importante para o combate ao cancro, especialmente em cancros resistentes.