Publicação
Hemocromatose hereditária não-clássica : pesquisa em genes relacionados com o metabolismo do ferro e estudos funcionais de uma nova variante da proteína hemojuvelina
| Resumo: | O ferro é um dos micronutrientes mais importantes a nível biológico, participando em diversos processos biológicos. Por outro lado, o seu excesso ou défice no organismo estão associados a consequências negativas para a saúde. A Hemocromatose Hereditária (HH) é um distúrbio da regulação da homeostase do ferro caracterizado por uma elevada absorção intestinal de ferro levando à sua acumulação em diversos órgãos. As consequências mais frequentes desta doença são o desenvolvimento de cirrose hepática, carcinoma hepatocelular, cardiomiopatias, artralgias, hiperpigmentação da pele e problemas endócrinos. O gene HFE é o principal gene associado a esta patologia (HH-clássica ou do tipo I). Os genótipos mais frequentes são a homozigotia para a alteração p.C282Y e a heterozigotia composta p.C282Y/p.H63D. No entanto, existem outros genes envolvidos no desenvolvimento de hemocromatose hereditária não clássica. Entre eles, encontra-se o gene TfR2 que codifica o recetor 2 da transferrina, estando associado à hemocromatose hereditária do tipo III e o gene SLC40A1 codificante da ferroportina e associado à hemocromatose hereditária do tipo IV. A forma mais grave de HH é, no entanto, a hemocromatose juvenil (HJ) ou tipo II associada a alterações nos genes que codificam a hemojuvelina (HJV) ou a hepcidina (HAMP). Um dos objetivos do trabalho subjacente a esta dissertação consistiu na implementação no laboratório de uma metodologia de pesquisa rápida, pouco dispendiosa e em larga escala, de alterações em genes relacionados com o metabolismo do ferro. Deste modo, foi possível realizar a identificação e caraterização de mutações em 6 genes relacionados com o metabolismo do ferro (HFE, HJV, HAMP, TfR2, SLC40A1 e FTL) em 88 doentes com sobrecarga em ferro (ferritina sérica superior a 200 ng/mL e saturação de transferrina superior a 60%), e diagnóstico negativo para Hemocromatose Hereditária do tipo I. Os DNAs foram preparados utilizando a metodologia Treu Seq Custum Amplicon e sequenciados recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, illumina. Através desta metodologia foram detetadas 1242 alterações correspondentes a 55 variantes genéticas diferentes, 16 das quais não estão descritas nas bases de dados disponíveis. Dessas 5 são potencialmente patogénicas (3 são missense HFE, p.Y230C, TfR2, p.L750V e TfR2, p.A777V; 1 localiza-se numa região de splicing no gene TfR2 (c.967-1 G>C) e 1 localiza-se na região 5’-UTR do gene HAMP (-25 G>A). Foram realizados estudos in silico, recorrendo à ferramenta bioinformática PolyPhen-2, de modo a identificar possíveis efeitos que estas mutações poderão ter na estrutura das proteínas resultantes. Para além disso, também se procedeu à análise do impacto da alteração nucleotídica a nível do splicing utilizando o software Human Splicing Finder. Dado o tipo de transmissão autossómica recessiva da hemocromatose hereditária, foi possível, através da metodologia utilizada, justificar a sobrecarga em ferro (estabelecer uma associação genótipo/fenótipo) em 5 dos indivíduos em estudo. O outro objetivo deste trabalho foi dar início ao estudo funcional in vitro da variante p.P124L da proteína HJV em células eucarióticas. Para tal procedeu-se à clonagem do cDNA wild-type HJV no vetor de expressão pEGFP-N1, originando uma proteína de fusão constituída por HJV e GFP (Green Fluorescent Protein). Posteriormente, e recorrendo a microscopia confocal e western-blot será analisada a sua distribuição intracelular na linha celular HeLa transfetada e o seu efeito no processamento da HJV. |
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| Autores principais: | Faria, Ricardo Manuel Pinheiro Freire de Albuquerque |
| Assunto: | Ferro Hemocromatose Hereditária Sobrecarga em ferro HFE HJV HAMP TfR2 SLC40A1 FTL Next Generation Sequencing p.P124L Teses de mestrado - 2015 |
| Ano: | 2015 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | português |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | O ferro é um dos micronutrientes mais importantes a nível biológico, participando em diversos processos biológicos. Por outro lado, o seu excesso ou défice no organismo estão associados a consequências negativas para a saúde. A Hemocromatose Hereditária (HH) é um distúrbio da regulação da homeostase do ferro caracterizado por uma elevada absorção intestinal de ferro levando à sua acumulação em diversos órgãos. As consequências mais frequentes desta doença são o desenvolvimento de cirrose hepática, carcinoma hepatocelular, cardiomiopatias, artralgias, hiperpigmentação da pele e problemas endócrinos. O gene HFE é o principal gene associado a esta patologia (HH-clássica ou do tipo I). Os genótipos mais frequentes são a homozigotia para a alteração p.C282Y e a heterozigotia composta p.C282Y/p.H63D. No entanto, existem outros genes envolvidos no desenvolvimento de hemocromatose hereditária não clássica. Entre eles, encontra-se o gene TfR2 que codifica o recetor 2 da transferrina, estando associado à hemocromatose hereditária do tipo III e o gene SLC40A1 codificante da ferroportina e associado à hemocromatose hereditária do tipo IV. A forma mais grave de HH é, no entanto, a hemocromatose juvenil (HJ) ou tipo II associada a alterações nos genes que codificam a hemojuvelina (HJV) ou a hepcidina (HAMP). Um dos objetivos do trabalho subjacente a esta dissertação consistiu na implementação no laboratório de uma metodologia de pesquisa rápida, pouco dispendiosa e em larga escala, de alterações em genes relacionados com o metabolismo do ferro. Deste modo, foi possível realizar a identificação e caraterização de mutações em 6 genes relacionados com o metabolismo do ferro (HFE, HJV, HAMP, TfR2, SLC40A1 e FTL) em 88 doentes com sobrecarga em ferro (ferritina sérica superior a 200 ng/mL e saturação de transferrina superior a 60%), e diagnóstico negativo para Hemocromatose Hereditária do tipo I. Os DNAs foram preparados utilizando a metodologia Treu Seq Custum Amplicon e sequenciados recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, illumina. Através desta metodologia foram detetadas 1242 alterações correspondentes a 55 variantes genéticas diferentes, 16 das quais não estão descritas nas bases de dados disponíveis. Dessas 5 são potencialmente patogénicas (3 são missense HFE, p.Y230C, TfR2, p.L750V e TfR2, p.A777V; 1 localiza-se numa região de splicing no gene TfR2 (c.967-1 G>C) e 1 localiza-se na região 5’-UTR do gene HAMP (-25 G>A). Foram realizados estudos in silico, recorrendo à ferramenta bioinformática PolyPhen-2, de modo a identificar possíveis efeitos que estas mutações poderão ter na estrutura das proteínas resultantes. Para além disso, também se procedeu à análise do impacto da alteração nucleotídica a nível do splicing utilizando o software Human Splicing Finder. Dado o tipo de transmissão autossómica recessiva da hemocromatose hereditária, foi possível, através da metodologia utilizada, justificar a sobrecarga em ferro (estabelecer uma associação genótipo/fenótipo) em 5 dos indivíduos em estudo. O outro objetivo deste trabalho foi dar início ao estudo funcional in vitro da variante p.P124L da proteína HJV em células eucarióticas. Para tal procedeu-se à clonagem do cDNA wild-type HJV no vetor de expressão pEGFP-N1, originando uma proteína de fusão constituída por HJV e GFP (Green Fluorescent Protein). Posteriormente, e recorrendo a microscopia confocal e western-blot será analisada a sua distribuição intracelular na linha celular HeLa transfetada e o seu efeito no processamento da HJV. |
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