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Probing the synaptic target of a new putative antiepileptic drug: modulation of the excitatory transmission in the hippocampus

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A complexidade do nosso sistema nervoso permite-nos apreciar momentos de reflexão, arte e imaginação, veiculada ou não pela linguagem. A unidade funcional que o permite é o neurónio, que dispara potenciais de acção seguidos de potenciais sinápticos que no conjunto são considerados a unidade básica de informação. O potencial de acção é um ponto central da regulação do sistema nervoso, que reflete não só a função de canais iónicos e outras estruturas que, ao nível subcelular, o modulam, mas também constitui a base da comunicação entre estruturas cerebrais e determina a coerência ou não de actividade neuronal. Os vários níveis de regulação do potencial de acção e do potencial sináptico interagem entre si e garantem o correcto controlo da excitabilidade. Contudo, dada essa flexível interacção, um pequeno desequilíbrio num dos níveis manifesta-se no sistema inteiro, como é o caso da epilepsia: uma mutação num canal de sódio dependente de voltagem, por exemplo, é suficiente para tornar o indivíduo susceptível a convulsões. Estas caracterizam-se por um desequilíbrio entre o tónus excitatório/inibitório que conduz a actividade neuronal anormal, excessiva e hipersíncrona no cérebro, tornando o indivíduo incapaz de conscientemente controlar o seu corpo por breves momentos, o que resulta frequentemente em fatalidades. Actualmente, 30% dos pacientes com epilepsia não respondem aos antiepilépticos actuais, ou seja, é fármaco-resistente, o que acarreta 75% do fardo socioeconómico associado a esta doença neurológica. Os mecanismos que estão na base da resistência aos fármacos são partilhados por outras patologias e não estão necessariamente relacionados com os mecanismos de epileptogénese per se. Para ultrapassar esta barreira, uma estratégia a seguir consiste em estudar os mecanismos endógenos anticonvulsivantes do cérebro e potenciá-los, como é o caso da adenosina. A adenosina é uma molécula ubíqua em todas as células do corpo humano, envolvida em processos básicos de suporte celular (como suporte estrutural nos ácidos nucleicos e suporte funcional na transferência de energia através de ATP). No sistema nervoso, é um importante neuromodulador que apresenta propriedades anticonvulsivantes, principalmente mediadas, mas não restringidas, ao receptor A1R da adenosina. Estes receptores são os mais abundantes, sendo expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo o sistema nervoso e o sistema cardiovascular. A activação dos receptores A1 tem um efeito anticonvulsivante ao diminuir a transmissão sináptica excitatória, diminuindo, assim, a probabilidade de actividade neuronal síncrona e excessiva. Os efeitos da activação dos receptores A1 manifestam-se pré- e pós sinapticamente. Pré-sinapticamente, a activação dos receptores A1 acoplados à proteína Gi/o resulta na diminuição de cálcio, necessário na libertação de vesículas de neurotransmissor. Assim, observa-se uma libertação de neurotransmissor assíncrona, responsável por um potencial excitatório pós-sináptico (EPSP) de menor amplitude. Pós-sinapticamente, a activação dos receptores A1 resulta na activação de canais de potássio, conduzindo à hiperpolarização do potencial de membrana. A redução da transmissão sináptica através dos receptores A1 deve-se, assim, à menor amplitude do potencial excitatório pós-sináptico, hiperpolarização do potencial de membrana e resistência da membrana diminuindo de modo global a transmissão sináptica. A utilização de adenosina em modelos de epilepsia fármaco-resistente foi capaz de prevenir convulsões. Contudo, a presença dos receptores A1 no sistema periférico, nomeadamente no sistema cardiovascular, tornam a administração sistémica da adenosina impraticável, dados os severos efeitos secundários resultantes da depressão da actividade cardíaca. Uma alternativa seria o desenvolvimento de análogos da adenosina que fossem selectivos e de elevada afinidade para os receptores A1R do sistema nervoso central e não para o sistema periférico. O fármaco MRS5474, desenvolvido pelo grupo de investigação do Prof. Keneth Jacobson, apresenta tais características, com um efeito anticonvulsivante num modelo de epilepsia fármaco-resistente (6Hz) quando administrado intraperitonealmente em ratinhos sem os típicos efeitos secundários periféricos observados por um agonista clássico selectivo dos receptores A1, CCPA. O mecanismo de acção do MRS5474 é ainda desconhecido, mas o seu efeito in vivo parece apontar para selectividade para o sistema nervoso em vez do sistema periférico. Tal pode ocorrer se o MRS5474 actuar apenas sobre um alvo sináptico que apenas se encontra presente no sistema nervoso central. Compreender o alvo sináptico e o mecanismo de acção do MRS5474 pode permitir a identificação de um novo alvo para o desenvolvimento de novos fármacos antiepilépticos. Neste trabalho, a hipótese testada foi a de que o MRS5474 diminui a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1 do hipocampo através de activação dos receptores A1. Esta estrutura é a mais implicada na epilepsia de lobo temporal, o tipo mais comum de epilepsia fármaco-resistente. De modo a estudar a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1, utilizaram-se fatias agudas de hipocampo de ratos wistar wild-type (3-8 semanas). As fibras que estimulam as células piramidais CA1 (Colaterais de Schaffer ou Via Perforante) foram electricamente estimuladas e as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSC) geradas em células piramidais CA1 registadas pela técnica de patch-clamp, no modo whole cell. Para se isolar a componente excitatória da transmissão sináptica, bloqueou-se farmacologicamente os receptores ionotrópicos GABAA responsáveis pela componente inibitória rápida, adicionando ao meio de perfusão Picrotoxina (50 μM). Após se obter estabilidade no registo da amplitude de EPSP (durante pelo menos 10 minutos) os fármacos a testar foram adicionados ao meio de perfusão, CCPA (30 nM) ou MRS5474 (120 nM), a concentrações aproximadamente equipotentes para os receptores A1. Em primeiro lugar, foi importante testar a activação dos receptores A1 com um agonista clássico selectivo (CCPA 30 nM), cujos efeitos estão amplamente descritos na literatura para obter um controlo experimental e metodológico. Observaram-se os efeitos esperados da activação dos receptores A1R: diminuição da amplitude das correntes pós-sinápticas excitatórias em 70 ± 5,2 % (n=4, p<0.001), diminuição da resistência membranar em 9,9±1,3% (n=4, p<0.05) e hiperpolarização do potencial de membrana estimado em 6,3±0,55 mV (n=3, p<001) a partir da medição de corrente injectada para manter o potencial de membrana constante a -70 mV. Relativamente ao MRS5474, este não alterou significativamente a amplitude dos EPSPs (128 ± 12,3%, n=8, p>0.05), embora se tenha observado uma elevada tendência para disparo de potencial de acção, contaminando os EPSPs e destabilizando o registo. De modo a isolar-se os EPSPs dos potenciais de acção, utilizou-se um bloqueador de canais de sódio dependentes da voltagem, QX-314 (5 mM), o que reduziu a variabilidade do efeito do MRS5474 sobre os EPSPs mas não o alterou significativamente (100 ± 2,40%, n=5, p>0.05). Dada a tendência que as células piramidais CA1 apresentaram para disparar potenciais de acção na presença de MRS5474, o seu efeito na excitabilidade intrínseca foi testado através do registo de padrões de disparo. A mesma fatia foi usada para medir padrões de disparo de células piramidais CA1 antes e depois da exposição (>1 hora) ao MRS5474. De facto, a presença de MRS5474 (120 nM) aumentou excitabilidade nas células piramidais CA1, através de despolarização da membrana (6,1±1,5 mV, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01), aumento da frequência de disparo de potenciais de acção (157 ±11,8%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e diminuição da amplitude das correntes rápida (fast) e média (médium) de hiperpolarização da fase de repolarização do potencial de acção (‘Afterhyperpolarization’ - AHP) fAHP (42±8,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e mAHP (28±5,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.001) a frequência máxima. Pode concluir-se que o MRS5474 (120 nM) facilita a excitabilidade das células piramidais CA1 no hipocampo, sem alterar as correntes sinápticas excitatórias, o que por si só não explica a sua acção anticonvulsivante in vivo. Pelo contrário, sugere um papel pro-excitatório do fármaco. Contudo, é necessário ter em conta que os resultados obtidos corresponderam às correntes excitatórias de células piramidais CA1 no hipocampo de ratos sem patologia. O efeito de MRS5474 (120 nM) na componente inibitória da transmissão sináptica das células piramidais CA1 assim como o seu efeito em interneurónios, células inibitórias, não foi ainda estudado. Contudo, é fundamental para se poder concluir acerca do mecanismo de acção do MRS5474 como anticonvulsivante, quer em condições depolarizantes (comuns durante convulsões) quer na excitabilidade de interneurónios.
Autores principais:	Domingos, Cátia Isabel Afonso
Assunto:	Epilepsia farmacoresistente Adenosina Receptores A1 para adenosina MRS5474 CCPA Teses de mestrado - 2016
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A complexidade do nosso sistema nervoso permite-nos apreciar momentos de reflexão, arte e imaginação, veiculada ou não pela linguagem. A unidade funcional que o permite é o neurónio, que dispara potenciais de acção seguidos de potenciais sinápticos que no conjunto são considerados a unidade básica de informação. O potencial de acção é um ponto central da regulação do sistema nervoso, que reflete não só a função de canais iónicos e outras estruturas que, ao nível subcelular, o modulam, mas também constitui a base da comunicação entre estruturas cerebrais e determina a coerência ou não de actividade neuronal. Os vários níveis de regulação do potencial de acção e do potencial sináptico interagem entre si e garantem o correcto controlo da excitabilidade. Contudo, dada essa flexível interacção, um pequeno desequilíbrio num dos níveis manifesta-se no sistema inteiro, como é o caso da epilepsia: uma mutação num canal de sódio dependente de voltagem, por exemplo, é suficiente para tornar o indivíduo susceptível a convulsões. Estas caracterizam-se por um desequilíbrio entre o tónus excitatório/inibitório que conduz a actividade neuronal anormal, excessiva e hipersíncrona no cérebro, tornando o indivíduo incapaz de conscientemente controlar o seu corpo por breves momentos, o que resulta frequentemente em fatalidades. Actualmente, 30% dos pacientes com epilepsia não respondem aos antiepilépticos actuais, ou seja, é fármaco-resistente, o que acarreta 75% do fardo socioeconómico associado a esta doença neurológica. Os mecanismos que estão na base da resistência aos fármacos são partilhados por outras patologias e não estão necessariamente relacionados com os mecanismos de epileptogénese per se. Para ultrapassar esta barreira, uma estratégia a seguir consiste em estudar os mecanismos endógenos anticonvulsivantes do cérebro e potenciá-los, como é o caso da adenosina. A adenosina é uma molécula ubíqua em todas as células do corpo humano, envolvida em processos básicos de suporte celular (como suporte estrutural nos ácidos nucleicos e suporte funcional na transferência de energia através de ATP). No sistema nervoso, é um importante neuromodulador que apresenta propriedades anticonvulsivantes, principalmente mediadas, mas não restringidas, ao receptor A1R da adenosina. Estes receptores são os mais abundantes, sendo expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo o sistema nervoso e o sistema cardiovascular. A activação dos receptores A1 tem um efeito anticonvulsivante ao diminuir a transmissão sináptica excitatória, diminuindo, assim, a probabilidade de actividade neuronal síncrona e excessiva. Os efeitos da activação dos receptores A1 manifestam-se pré- e pós sinapticamente. Pré-sinapticamente, a activação dos receptores A1 acoplados à proteína Gi/o resulta na diminuição de cálcio, necessário na libertação de vesículas de neurotransmissor. Assim, observa-se uma libertação de neurotransmissor assíncrona, responsável por um potencial excitatório pós-sináptico (EPSP) de menor amplitude. Pós-sinapticamente, a activação dos receptores A1 resulta na activação de canais de potássio, conduzindo à hiperpolarização do potencial de membrana. A redução da transmissão sináptica através dos receptores A1 deve-se, assim, à menor amplitude do potencial excitatório pós-sináptico, hiperpolarização do potencial de membrana e resistência da membrana diminuindo de modo global a transmissão sináptica. A utilização de adenosina em modelos de epilepsia fármaco-resistente foi capaz de prevenir convulsões. Contudo, a presença dos receptores A1 no sistema periférico, nomeadamente no sistema cardiovascular, tornam a administração sistémica da adenosina impraticável, dados os severos efeitos secundários resultantes da depressão da actividade cardíaca. Uma alternativa seria o desenvolvimento de análogos da adenosina que fossem selectivos e de elevada afinidade para os receptores A1R do sistema nervoso central e não para o sistema periférico. O fármaco MRS5474, desenvolvido pelo grupo de investigação do Prof. Keneth Jacobson, apresenta tais características, com um efeito anticonvulsivante num modelo de epilepsia fármaco-resistente (6Hz) quando administrado intraperitonealmente em ratinhos sem os típicos efeitos secundários periféricos observados por um agonista clássico selectivo dos receptores A1, CCPA. O mecanismo de acção do MRS5474 é ainda desconhecido, mas o seu efeito in vivo parece apontar para selectividade para o sistema nervoso em vez do sistema periférico. Tal pode ocorrer se o MRS5474 actuar apenas sobre um alvo sináptico que apenas se encontra presente no sistema nervoso central. Compreender o alvo sináptico e o mecanismo de acção do MRS5474 pode permitir a identificação de um novo alvo para o desenvolvimento de novos fármacos antiepilépticos. Neste trabalho, a hipótese testada foi a de que o MRS5474 diminui a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1 do hipocampo através de activação dos receptores A1. Esta estrutura é a mais implicada na epilepsia de lobo temporal, o tipo mais comum de epilepsia fármaco-resistente. De modo a estudar a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1, utilizaram-se fatias agudas de hipocampo de ratos wistar wild-type (3-8 semanas). As fibras que estimulam as células piramidais CA1 (Colaterais de Schaffer ou Via Perforante) foram electricamente estimuladas e as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSC) geradas em células piramidais CA1 registadas pela técnica de patch-clamp, no modo whole cell. Para se isolar a componente excitatória da transmissão sináptica, bloqueou-se farmacologicamente os receptores ionotrópicos GABAA responsáveis pela componente inibitória rápida, adicionando ao meio de perfusão Picrotoxina (50 μM). Após se obter estabilidade no registo da amplitude de EPSP (durante pelo menos 10 minutos) os fármacos a testar foram adicionados ao meio de perfusão, CCPA (30 nM) ou MRS5474 (120 nM), a concentrações aproximadamente equipotentes para os receptores A1. Em primeiro lugar, foi importante testar a activação dos receptores A1 com um agonista clássico selectivo (CCPA 30 nM), cujos efeitos estão amplamente descritos na literatura para obter um controlo experimental e metodológico. Observaram-se os efeitos esperados da activação dos receptores A1R: diminuição da amplitude das correntes pós-sinápticas excitatórias em 70 ± 5,2 % (n=4, p<0.001), diminuição da resistência membranar em 9,9±1,3% (n=4, p<0.05) e hiperpolarização do potencial de membrana estimado em 6,3±0,55 mV (n=3, p<001) a partir da medição de corrente injectada para manter o potencial de membrana constante a -70 mV. Relativamente ao MRS5474, este não alterou significativamente a amplitude dos EPSPs (128 ± 12,3%, n=8, p>0.05), embora se tenha observado uma elevada tendência para disparo de potencial de acção, contaminando os EPSPs e destabilizando o registo. De modo a isolar-se os EPSPs dos potenciais de acção, utilizou-se um bloqueador de canais de sódio dependentes da voltagem, QX-314 (5 mM), o que reduziu a variabilidade do efeito do MRS5474 sobre os EPSPs mas não o alterou significativamente (100 ± 2,40%, n=5, p>0.05). Dada a tendência que as células piramidais CA1 apresentaram para disparar potenciais de acção na presença de MRS5474, o seu efeito na excitabilidade intrínseca foi testado através do registo de padrões de disparo. A mesma fatia foi usada para medir padrões de disparo de células piramidais CA1 antes e depois da exposição (>1 hora) ao MRS5474. De facto, a presença de MRS5474 (120 nM) aumentou excitabilidade nas células piramidais CA1, através de despolarização da membrana (6,1±1,5 mV, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01), aumento da frequência de disparo de potenciais de acção (157 ±11,8%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e diminuição da amplitude das correntes rápida (fast) e média (médium) de hiperpolarização da fase de repolarização do potencial de acção (‘Afterhyperpolarization’ - AHP) fAHP (42±8,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e mAHP (28±5,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.001) a frequência máxima. Pode concluir-se que o MRS5474 (120 nM) facilita a excitabilidade das células piramidais CA1 no hipocampo, sem alterar as correntes sinápticas excitatórias, o que por si só não explica a sua acção anticonvulsivante in vivo. Pelo contrário, sugere um papel pro-excitatório do fármaco. Contudo, é necessário ter em conta que os resultados obtidos corresponderam às correntes excitatórias de células piramidais CA1 no hipocampo de ratos sem patologia. O efeito de MRS5474 (120 nM) na componente inibitória da transmissão sináptica das células piramidais CA1 assim como o seu efeito em interneurónios, células inibitórias, não foi ainda estudado. Contudo, é fundamental para se poder concluir acerca do mecanismo de acção do MRS5474 como anticonvulsivante, quer em condições depolarizantes (comuns durante convulsões) quer na excitabilidade de interneurónios.