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Role of neurotrophic factor receptors in Innate Lymphoid Cell immunity

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O intestino humano é considerado o maior compartimento do sistema imunitário, tendo constantemente de enfrentar e responder de forma eficiente a sinais e perigos externos, como antigénios e moléculas imunomodulatórias provenientes de várias fontes, incluindo o nosso próprio microbioma intestinal (1). Isto deve-se ao lúmen intestinal estar em contato direto com tudo aquilo que é ingerido, funcionando como uma porta seletiva entre o meio-ambiente e o corpo e até mesmo como um potencial nicho onde bactérias patogénicas se podem desenvolver e levar a situações de doença, podendo inclusive ser considerado uma parte exterior do nosso corpo. Adicionalmente, o sistema imunitário tem de integrar e modular os sinais provenientes do microbioma intestinal, que coevoluiu com os seus hospedeiros, estabelecendo uma relação simbiótica com eles de várias formas (2, 3), ajudando na manutenção da homeostasia, metabolizando compostos que de outra forma seriam indigeríveis, competindo e prevenindo que outras bactérias colonizem o trato intestinal e sendo até capaz de modular o próprio sistema imunitário (4). Em troca, nós oferecemos-lhes uma fonte estável e constante de nutrientes e um ambiente relativamente estável onde podem crescer e proliferar. (4). No entanto, em certas condições, quando o sistema imunitário não consegue regular e controlar devidamente as bactérias comensais, algumas delas podem tornar-se patogénicas (5). Ainda assim, é notável a forma como o sistema imunitário consegue lidar simultaneamente com as bactérias comensais e bactérias patogénicas, de forma a garantir a homeostasia intestinal em situações simultaneamente tão semelhantes e diversas. É fácil de imaginar que o que observamos hoje em dia foi o resultado de uma enorme pressão evolutiva para garantir o bom funcionamento do nosso sistema imunitário intestinal. Entre as várias células que fazem parte do sistema imune inato e adaptativo e que têm um papel fundamental na regulação e manutenção da homeostasia, existe uma família emergente de células inatas de morfologia linfoide, as Innate Lymphoid Cells (ILCs). O seu papel em processos biológicos tem vindo a ser revelado ao longo destes últimos anos. Sabe-se atualmente que as ILCs tem um papel na iniciação, mediação e resolução de estados inflamatórios, integram sinais do microbioma, têm um papel na formação e reparação de órgãos linfoides, reconhecem e produzem citocinas imunomodulatórias e são inclusive capazes de modular a resposta do sistema imune adaptativo. As ILCs identificam-se pela ausência de marcadores clássicos de células B, T, mieloides ou granulócitos. No entanto, expressam alguns marcadores presentes noutros leucócitos, como no caso da cadeia gamma (γc, CD132), IL-7Rα (CD127), IL-2Rα (CD25), e Thy1 (CD90). Esta família de células foi recentemente dividida em 3 grupos, de acordo com a expressão de fatores de transcrição específicos e perfis de expressão de citocinas. Atualmente, considera-se existirem ILCs de tipo 1, 2 e 3 (6-14). As ILCs de tipo 3 são um grupo relativamente heterogéneo de células, encontrando-se divididas em ILC3s e em células Lymphoid Tissue Inducer (células LTi). Estas células fazem parte do sistema imunitário das mucosas, estando presentes no intestino delgado e grosso e sendo produtoras de IL-22 (15). As ILC3s são definidas em ratinhos como sendo Lin- RORγt+ (e também Thy1+ IL-7Rαint C-Kitint CCR6-, com uma percentagem sendo NKp46+), enquanto que as células LTi são caracterizadas como Lin- RORγt+ NKp46- (e também Thy1+ IL-7Rαhi C-Kithi CXCR5+ CCR6+), com uma percentagem sendo CD4+. Este subtipo de células foi considerado como o grupo mais importante na produção de IL-22 numa situação de estado estacionário (16) e como tendo um papel extremamente importante na organogénese linfoide no feto (17-19), sendo ainda potentes produtores de IL-22 na fase adulta em ratinhos (20). No nosso laboratório, foi verificado que estas células expressam um recetor de fatores neurotróficos – RET (21). Também observámos que a percentagem de ILC3s IL-22+ se encontra reduzida em ratinhos com uma deleção condicional de RET em células RORγt+ (Rorc-Cre Retflox/flox). Estes ratinhos foram denominados RetΔ. Em contraste, ratinhos com uma mutação genética em que existe um ganho de função de RET (RetMEN2B/MEN2B), em que o recetor se encontra ativo de forma constitutiva, apresentavam uma maior percentagem de ILC3s IL-22+. Isto correlacionou-se com a reatividade epitelial destes ratinhos, sendo que a ausência de RET especificamente em ILC3s levava a que existisse uma menor expressão de genes associados à integridade epitelial. Pelo contrário, ativação constitutiva de RET levava a que existisse uma maior expressão de genes associados à reatividade epitelial. Isto fez-nos pensar que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s, e que seria essa proteína a principal responsável pelas diferenças observadas, o que faz sentido se tivermos em conta o efeito que a IL-22 tem no epitélio. Esta proteína está descrita como tendo um papel antimicrobiano, regeneração de feridas e tecidos (22-24) e como sendo necessária para evitar a disseminação microbiana. (8, 25) Com este trabalho, pretendemos portanto analisar se era esta alteração na produção de IL-22 que levava às diferenças observadas entre ratinhos mutantes e wild type, e não outro fator (igualmente dependente de RET) que não estava a ser tido em conta. Para conseguir isto, decidimos inicialmente induzir a produção de IL-22 em células ILC3 de ratinhos RetΔ de forma independente de RET, e verificar se seria possível “recuperar o fenótipo” observado em ratinhos wild type. Para tal, criámos um vírus capaz de infetar este tipo de células e induzir uma produção constitutiva de IL-22. Embora tenhamos conseguido infetar uma percentagem de ILC3s, tendo efetivamente desenvolvido, de acordo com o nosso conhecimento, o primeiro método para inserir genes neste tipo de células, o processo é relativamente stressante para as mesmas e não nos foi possível recuperar um número suficiente de células para realizar um ensaio in vivo. Paralelamente, desenhámos um método in vitro que nos permitiu estudar a interação de ILC3s com o epitélio intestinal. Foi-nos possível purificar estas células diretamente de ratinhos e realizar uma co-cultura com organoides intestinais (também conhecidos como “mini guts” - modelos ex-vivo do epitélio (26)), medindo a expressão de vários genes que são upregulated pela IL-22. Foi possível observar uma upregulation bastante evidente de alguns destes genes após uma co-cultura com ILC3s de ratinhos wild type, tanto constitutivamente como após uma estimulação com IL-23, o que nos permitiu validar o método de co-cultura e mostrar que as ILC3s tinham, de forma autónoma, a capacidade de estimular um aumento na reatividade epitelial. Esta estimulação encontrava-se bastante reduzida na presença de um anticorpo capaz de neutralizar o efeito de IL-22, o que indica que os efeitos observados dependiam diretamente da atividade de IL-22. De seguida, estimulámos as células com ligandos de RET, e conseguimos observar um aumento na expressão destes mesmos genes, encontrando-se igualmente reduzida na presença do anticorpo anti-IL-22. Este efeito não se verificou em células cuja expressão de RET se encontrava afetada, o que fortaleceu a hipótese de que esta citocina é o fator que se encontra downstream de RET e que é responsável pelas alterações verificadas na reatividade epitelial de ratinhos com mutações neste recetor, indicando portanto que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s e que essa produção está afetada quando a função de RET se encontra alterada, pelo que esta é a causa pelos diferentes fenótipos observados e descritos anteriormente.
Autores principais:	Almeida, Luís Miguel Ferreira de
Assunto:	RET Innate lymphoid cells Interleukin-22 Epithelial reactivity Intestinal organoids Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O intestino humano é considerado o maior compartimento do sistema imunitário, tendo constantemente de enfrentar e responder de forma eficiente a sinais e perigos externos, como antigénios e moléculas imunomodulatórias provenientes de várias fontes, incluindo o nosso próprio microbioma intestinal (1). Isto deve-se ao lúmen intestinal estar em contato direto com tudo aquilo que é ingerido, funcionando como uma porta seletiva entre o meio-ambiente e o corpo e até mesmo como um potencial nicho onde bactérias patogénicas se podem desenvolver e levar a situações de doença, podendo inclusive ser considerado uma parte exterior do nosso corpo. Adicionalmente, o sistema imunitário tem de integrar e modular os sinais provenientes do microbioma intestinal, que coevoluiu com os seus hospedeiros, estabelecendo uma relação simbiótica com eles de várias formas (2, 3), ajudando na manutenção da homeostasia, metabolizando compostos que de outra forma seriam indigeríveis, competindo e prevenindo que outras bactérias colonizem o trato intestinal e sendo até capaz de modular o próprio sistema imunitário (4). Em troca, nós oferecemos-lhes uma fonte estável e constante de nutrientes e um ambiente relativamente estável onde podem crescer e proliferar. (4). No entanto, em certas condições, quando o sistema imunitário não consegue regular e controlar devidamente as bactérias comensais, algumas delas podem tornar-se patogénicas (5). Ainda assim, é notável a forma como o sistema imunitário consegue lidar simultaneamente com as bactérias comensais e bactérias patogénicas, de forma a garantir a homeostasia intestinal em situações simultaneamente tão semelhantes e diversas. É fácil de imaginar que o que observamos hoje em dia foi o resultado de uma enorme pressão evolutiva para garantir o bom funcionamento do nosso sistema imunitário intestinal. Entre as várias células que fazem parte do sistema imune inato e adaptativo e que têm um papel fundamental na regulação e manutenção da homeostasia, existe uma família emergente de células inatas de morfologia linfoide, as Innate Lymphoid Cells (ILCs). O seu papel em processos biológicos tem vindo a ser revelado ao longo destes últimos anos. Sabe-se atualmente que as ILCs tem um papel na iniciação, mediação e resolução de estados inflamatórios, integram sinais do microbioma, têm um papel na formação e reparação de órgãos linfoides, reconhecem e produzem citocinas imunomodulatórias e são inclusive capazes de modular a resposta do sistema imune adaptativo. As ILCs identificam-se pela ausência de marcadores clássicos de células B, T, mieloides ou granulócitos. No entanto, expressam alguns marcadores presentes noutros leucócitos, como no caso da cadeia gamma (γc, CD132), IL-7Rα (CD127), IL-2Rα (CD25), e Thy1 (CD90). Esta família de células foi recentemente dividida em 3 grupos, de acordo com a expressão de fatores de transcrição específicos e perfis de expressão de citocinas. Atualmente, considera-se existirem ILCs de tipo 1, 2 e 3 (6-14). As ILCs de tipo 3 são um grupo relativamente heterogéneo de células, encontrando-se divididas em ILC3s e em células Lymphoid Tissue Inducer (células LTi). Estas células fazem parte do sistema imunitário das mucosas, estando presentes no intestino delgado e grosso e sendo produtoras de IL-22 (15). As ILC3s são definidas em ratinhos como sendo Lin- RORγt+ (e também Thy1+ IL-7Rαint C-Kitint CCR6-, com uma percentagem sendo NKp46+), enquanto que as células LTi são caracterizadas como Lin- RORγt+ NKp46- (e também Thy1+ IL-7Rαhi C-Kithi CXCR5+ CCR6+), com uma percentagem sendo CD4+. Este subtipo de células foi considerado como o grupo mais importante na produção de IL-22 numa situação de estado estacionário (16) e como tendo um papel extremamente importante na organogénese linfoide no feto (17-19), sendo ainda potentes produtores de IL-22 na fase adulta em ratinhos (20). No nosso laboratório, foi verificado que estas células expressam um recetor de fatores neurotróficos – RET (21). Também observámos que a percentagem de ILC3s IL-22+ se encontra reduzida em ratinhos com uma deleção condicional de RET em células RORγt+ (Rorc-Cre Retflox/flox). Estes ratinhos foram denominados RetΔ. Em contraste, ratinhos com uma mutação genética em que existe um ganho de função de RET (RetMEN2B/MEN2B), em que o recetor se encontra ativo de forma constitutiva, apresentavam uma maior percentagem de ILC3s IL-22+. Isto correlacionou-se com a reatividade epitelial destes ratinhos, sendo que a ausência de RET especificamente em ILC3s levava a que existisse uma menor expressão de genes associados à integridade epitelial. Pelo contrário, ativação constitutiva de RET levava a que existisse uma maior expressão de genes associados à reatividade epitelial. Isto fez-nos pensar que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s, e que seria essa proteína a principal responsável pelas diferenças observadas, o que faz sentido se tivermos em conta o efeito que a IL-22 tem no epitélio. Esta proteína está descrita como tendo um papel antimicrobiano, regeneração de feridas e tecidos (22-24) e como sendo necessária para evitar a disseminação microbiana. (8, 25) Com este trabalho, pretendemos portanto analisar se era esta alteração na produção de IL-22 que levava às diferenças observadas entre ratinhos mutantes e wild type, e não outro fator (igualmente dependente de RET) que não estava a ser tido em conta. Para conseguir isto, decidimos inicialmente induzir a produção de IL-22 em células ILC3 de ratinhos RetΔ de forma independente de RET, e verificar se seria possível “recuperar o fenótipo” observado em ratinhos wild type. Para tal, criámos um vírus capaz de infetar este tipo de células e induzir uma produção constitutiva de IL-22. Embora tenhamos conseguido infetar uma percentagem de ILC3s, tendo efetivamente desenvolvido, de acordo com o nosso conhecimento, o primeiro método para inserir genes neste tipo de células, o processo é relativamente stressante para as mesmas e não nos foi possível recuperar um número suficiente de células para realizar um ensaio in vivo. Paralelamente, desenhámos um método in vitro que nos permitiu estudar a interação de ILC3s com o epitélio intestinal. Foi-nos possível purificar estas células diretamente de ratinhos e realizar uma co-cultura com organoides intestinais (também conhecidos como “mini guts” - modelos ex-vivo do epitélio (26)), medindo a expressão de vários genes que são upregulated pela IL-22. Foi possível observar uma upregulation bastante evidente de alguns destes genes após uma co-cultura com ILC3s de ratinhos wild type, tanto constitutivamente como após uma estimulação com IL-23, o que nos permitiu validar o método de co-cultura e mostrar que as ILC3s tinham, de forma autónoma, a capacidade de estimular um aumento na reatividade epitelial. Esta estimulação encontrava-se bastante reduzida na presença de um anticorpo capaz de neutralizar o efeito de IL-22, o que indica que os efeitos observados dependiam diretamente da atividade de IL-22. De seguida, estimulámos as células com ligandos de RET, e conseguimos observar um aumento na expressão destes mesmos genes, encontrando-se igualmente reduzida na presença do anticorpo anti-IL-22. Este efeito não se verificou em células cuja expressão de RET se encontrava afetada, o que fortaleceu a hipótese de que esta citocina é o fator que se encontra downstream de RET e que é responsável pelas alterações verificadas na reatividade epitelial de ratinhos com mutações neste recetor, indicando portanto que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s e que essa produção está afetada quando a função de RET se encontra alterada, pelo que esta é a causa pelos diferentes fenótipos observados e descritos anteriormente.