Publicação

HIV infection and follicular helper T cells : interrogating the SAMHD1 contribution through HIV-2

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O vírus da imunodeficiência humana (VIH) continua a representar um problema global de saúde. Atualmente 38,4 milhões de pessoas vivem infetadas com o VIH, tendo sido descritos 1,5 milhões de novos casos em 2021. Apesar de tanto VIH tipo 1 (VIH-1) como tipo 2 (VIH-2) poderem levar ao desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), há uma associação mais frequente do VIH-1 a um trajeto relativamente mais fulminante. O VIH-2, por outro lado, associa-se comumente a um percurso mais insidioso, lento e quase “benigno”, sendo que alguns doentes vivem uma vida com reduzidas comorbilidades, carga viral baixa e não chegam a desenvolver SIDA. Tanto VIH-1 como VIH-2 podem sofrer mutações que conferem ao vírus resistência aos tratamentos disponíveis, reforçando a importância dos estudos do VIH não só para minimizar os efeitos adversos dos antirretrovirais, mas também para explorar estratégias para a eliminação das células infetadas. A infeção pelo VIH tipo 1 (VIH-1) e tipo 2 (VIH-2) apresenta variadas semelhanças, nomeadamente as mesmas vias de transmissão, o alvo de células T CD4 e a utilização de CD4 como recetor principal e de CXCR4 e/ou CCR5 como coreceptores. No entanto, existem algumas diferenças a nível molecular e no estabelecimento e progressão da infeção. A nível molecular, existem diferenças nas suas proteínas, como por exemplo os complexos de glicoproteínas do envelope que facilitam a entrada do vírus na célula são diferentes (gp120 e gp41 no VIH-1, gp105 e gp36 no VIH-2), ainda que equivalentes entre si. As proteínas acessórias entre VIH-1 e VIH-2 também diferem, nomeadamente a ausência da proteína Vpu e a presença da proteína Vpx no caso do VIH-2 em comparação com VIH-1. Ainda que seja possível controlar a infeção por VIH com recurso à terapia antirretroviral, esta não erradica as células infetadas pelo vírus, denominadas reservatórios virais, que podem permanecer num estado latente por um período indeterminado, através de mecanismos que ainda não estão totalmente esclarecidos. Apesar de várias células que expressam o recetor CD4 serem reservatórios virais, algumas subpopulações de células T CD4 são considerados mais relevantes. As células T CD4 auxiliares foliculares (Tfh) são um reservatório importante tanto para VIH-1 como VIH-2. Tfh são uma subpopulação. especializada de linfócitos CD4 que se localizam nos órgãos linfoides secundários, nomeadamente na amígdala. Estas células caracterizam-se pela elevada expressão de marcadores celulares como CXCR5, ICOS e PD-1 – marcadores estes que definem a linhagem Tfh –, mas também de Bcl-6, o principal regulador da diferenciação das Tfh. Não só Bcl-6 está envolvido na diferenciação das Tfh, como tem um impacto na suscetibilidade das Tfh à infeção por VIH ao modular fatores de restrição contra estes vírus. Um destes fatores de restrição do hospedeiro é SAMHD1 (do inglês sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1), que é uma proteína com função de dNTPase, que regula a concentração de desoxiribonucleótidos fosfatados (dNTPs) no citosol, hidrolisando-os, e reduzindo a sua disponibilidade quando a enzima se encontra no seu estado desfosforilado, e, portanto, ativo. Quando fosforilado, SAMHD1 correlaciona-se com níveis mais elevados de dNTPs, traduzindo-se numa diminuição desta atividade enzimática, permitindo a replicação do DNA celular durante a fase S, e assim reduzindo estes níveis em células quiescentes nas quais se registam níveis mais elevados de SAMHD1. Além deste papel no ciclo celular, a redução da disponibilidade de dNTPs inibe a transcrição reversa do VIH e, adicionalmente, estudos mostraram que o SAMHD1 impede a expressão de genes do VIH-1, demonstrando a sua importância enquanto fator de restrição de hospedeiro contra o VIH. O VIH-2 é capaz combater SAMHD1 pela expressão da referida proteína Vpx que direciona SAMHD1 para degradação proteossómica, ultrapassando este mecanismo de restrição. Estudos prévios também demonstraram que a Vpx confere uma vantagem para o estabelecimento da infeção quando associada ao VIH-1. Apesar de sabermos que Tfh expressam elevados níveis de Bcl-6 e baixos níveis de SAMHD1, pouco se sabe acerca do papel de SAMHD1 na suscetibilidade das Tfh à infeção pelo VIH. Neste estudo exploramos a capacidade de degradação do SAMHD1 através do VIH-2, conferida pela proteína Vpx, para melhor investigar a interação entre SAMHD1 e HIV em células Tfh. Tendo esses aspetos em conta, colocamos a hipótese de que, através da diminuição dos níveis de SAMHD1 que conferem um entrave à replicação do VIH, o VIH-2 apresentaria algum tipo de vantagem em infetar estes subpopulações celulares de T CD4, nomeadamente no caso de células quiescentes que apresentam os referidos níveis constitutivamente elevados de SAMHD1 e que serão, por esse motivo, menos suscetíveis à infeção na ausência da Vpx. Questionámos, ainda, se esta modulação negativa dos níveis de SAMHD1 pelo VIH-2 impactaria de modo algum o processo de diferenciação das Tfh, comparativamente a células infetadas por VIH-1 e células não infetadas. Primeiramente, explorámos a infeção por HIV-2 de subpopulações purificadas a partir de células mononucleares isoladas de amígdalas humanas obtidas eticamente, com níveis distintos de SAMHD1, nomeadamente Tfh (CXCR5+ICOSbrightPD-1bright) e triple negative (TN, CXCR5negICOSnegPD-1neg), posteriormente infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com tropismos diferentes para os coreceptores, CXCR4 ou CCR5. Analisando os dados gerados, observámos que, apesar de uma maior expressão de SAMHD1, as TN apresentaram elevados níveis de DNA viral total e gag mRNA após 24h de infeção com isolados primários de VIH-2 ou VIH-1, independentemente do coreceptor utilizado. Tanto VIH-1 como VIH-2 conseguem infetar TN e Tfh, indiciando uma ausência de vantagem para o VIH-2 no combate ao SAMHD1. Todavia, os níveis de DNA viral total foram superiores nas Tfh, para ambas as infeções, o que está de acordo com o descrito na literatura. Apesar dos níveis baixos de SAMHD1 em Tfh em comparação com TN, verificámos que existe uma heterogeneidade da expressão de SAMHD1 em células que expressam CXCR5, que não aparenta estar relacionada com a expressão de nenhum marcador característico das Tfh, nomeadamente Bcl-6, OX40, e CD57. Para avaliar se a infeção pelo VIH-2, e consequentemente a diminuição de SAMHD1 por Vpx, tem impacto na produção de Tfh, realizámos um ensaio com base num protocolo previamente padronizado para a diferenciação in vitro de Tfh. Para isso, células T CD4 naïve isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico foram estimuladas e mantidas em cultura com um cocktail de citocinas para promover a diferenciação das Tfh. Estas células foram infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com duplo tropismo para CXCR4 e CCR5, de forma a contornar qualquer viés induzido pelo tropismo para um determinado coreceptor. Realizámos fenotipagem por citometria fluxo e recolhemos cell pellets para PCR quantitativo em diferentes dias de cultura. Surpreendentemente, a frequência das Tfh geradas demonstraram-se semelhantes após infeção com VIH-2 e VIH-1, bem como quando comparadas com o controlo não infetado. Mais, as Tfh geradas neste protocolo apresentam expressão semelhante de diversos marcadores associados às Tfh, indicando um fenótipo similar independentemente da condição de infeção (VIH-2, VIH-1 ou o controlo não infetado). Concluindo, o VIH-2, apesar de hospedar a Vpx, não apresentou vantagem significativa em infetar células T CD4 amigdalinas humanas, independentemente dos seus níveis distintos de SAMHD1. Para além disso, a infeção pelo VIH-2 não modulou a quantidade ou a qualidade das células Tfh geradas com o protocolo diferenciação in vitro de Tfh. Estes primeiros dados utilizando isolados primários de VIH-2 incentivam a investigação de mecanismos adicionais no estabelecimento de reservatórios Tfh, bem como as suas implicações na infeção por VIH-2.
Autores principais:	Pires, André Lopes Reis Gomes
Assunto:	VIH-2 VIH-1 Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) Células T auxiliares foliculares Imunologia
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O vírus da imunodeficiência humana (VIH) continua a representar um problema global de saúde. Atualmente 38,4 milhões de pessoas vivem infetadas com o VIH, tendo sido descritos 1,5 milhões de novos casos em 2021. Apesar de tanto VIH tipo 1 (VIH-1) como tipo 2 (VIH-2) poderem levar ao desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), há uma associação mais frequente do VIH-1 a um trajeto relativamente mais fulminante. O VIH-2, por outro lado, associa-se comumente a um percurso mais insidioso, lento e quase “benigno”, sendo que alguns doentes vivem uma vida com reduzidas comorbilidades, carga viral baixa e não chegam a desenvolver SIDA. Tanto VIH-1 como VIH-2 podem sofrer mutações que conferem ao vírus resistência aos tratamentos disponíveis, reforçando a importância dos estudos do VIH não só para minimizar os efeitos adversos dos antirretrovirais, mas também para explorar estratégias para a eliminação das células infetadas. A infeção pelo VIH tipo 1 (VIH-1) e tipo 2 (VIH-2) apresenta variadas semelhanças, nomeadamente as mesmas vias de transmissão, o alvo de células T CD4 e a utilização de CD4 como recetor principal e de CXCR4 e/ou CCR5 como coreceptores. No entanto, existem algumas diferenças a nível molecular e no estabelecimento e progressão da infeção. A nível molecular, existem diferenças nas suas proteínas, como por exemplo os complexos de glicoproteínas do envelope que facilitam a entrada do vírus na célula são diferentes (gp120 e gp41 no VIH-1, gp105 e gp36 no VIH-2), ainda que equivalentes entre si. As proteínas acessórias entre VIH-1 e VIH-2 também diferem, nomeadamente a ausência da proteína Vpu e a presença da proteína Vpx no caso do VIH-2 em comparação com VIH-1. Ainda que seja possível controlar a infeção por VIH com recurso à terapia antirretroviral, esta não erradica as células infetadas pelo vírus, denominadas reservatórios virais, que podem permanecer num estado latente por um período indeterminado, através de mecanismos que ainda não estão totalmente esclarecidos. Apesar de várias células que expressam o recetor CD4 serem reservatórios virais, algumas subpopulações de células T CD4 são considerados mais relevantes. As células T CD4 auxiliares foliculares (Tfh) são um reservatório importante tanto para VIH-1 como VIH-2. Tfh são uma subpopulação. especializada de linfócitos CD4 que se localizam nos órgãos linfoides secundários, nomeadamente na amígdala. Estas células caracterizam-se pela elevada expressão de marcadores celulares como CXCR5, ICOS e PD-1 – marcadores estes que definem a linhagem Tfh –, mas também de Bcl-6, o principal regulador da diferenciação das Tfh. Não só Bcl-6 está envolvido na diferenciação das Tfh, como tem um impacto na suscetibilidade das Tfh à infeção por VIH ao modular fatores de restrição contra estes vírus. Um destes fatores de restrição do hospedeiro é SAMHD1 (do inglês sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1), que é uma proteína com função de dNTPase, que regula a concentração de desoxiribonucleótidos fosfatados (dNTPs) no citosol, hidrolisando-os, e reduzindo a sua disponibilidade quando a enzima se encontra no seu estado desfosforilado, e, portanto, ativo. Quando fosforilado, SAMHD1 correlaciona-se com níveis mais elevados de dNTPs, traduzindo-se numa diminuição desta atividade enzimática, permitindo a replicação do DNA celular durante a fase S, e assim reduzindo estes níveis em células quiescentes nas quais se registam níveis mais elevados de SAMHD1. Além deste papel no ciclo celular, a redução da disponibilidade de dNTPs inibe a transcrição reversa do VIH e, adicionalmente, estudos mostraram que o SAMHD1 impede a expressão de genes do VIH-1, demonstrando a sua importância enquanto fator de restrição de hospedeiro contra o VIH. O VIH-2 é capaz combater SAMHD1 pela expressão da referida proteína Vpx que direciona SAMHD1 para degradação proteossómica, ultrapassando este mecanismo de restrição. Estudos prévios também demonstraram que a Vpx confere uma vantagem para o estabelecimento da infeção quando associada ao VIH-1. Apesar de sabermos que Tfh expressam elevados níveis de Bcl-6 e baixos níveis de SAMHD1, pouco se sabe acerca do papel de SAMHD1 na suscetibilidade das Tfh à infeção pelo VIH. Neste estudo exploramos a capacidade de degradação do SAMHD1 através do VIH-2, conferida pela proteína Vpx, para melhor investigar a interação entre SAMHD1 e HIV em células Tfh. Tendo esses aspetos em conta, colocamos a hipótese de que, através da diminuição dos níveis de SAMHD1 que conferem um entrave à replicação do VIH, o VIH-2 apresentaria algum tipo de vantagem em infetar estes subpopulações celulares de T CD4, nomeadamente no caso de células quiescentes que apresentam os referidos níveis constitutivamente elevados de SAMHD1 e que serão, por esse motivo, menos suscetíveis à infeção na ausência da Vpx. Questionámos, ainda, se esta modulação negativa dos níveis de SAMHD1 pelo VIH-2 impactaria de modo algum o processo de diferenciação das Tfh, comparativamente a células infetadas por VIH-1 e células não infetadas. Primeiramente, explorámos a infeção por HIV-2 de subpopulações purificadas a partir de células mononucleares isoladas de amígdalas humanas obtidas eticamente, com níveis distintos de SAMHD1, nomeadamente Tfh (CXCR5+ICOSbrightPD-1bright) e triple negative (TN, CXCR5negICOSnegPD-1neg), posteriormente infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com tropismos diferentes para os coreceptores, CXCR4 ou CCR5. Analisando os dados gerados, observámos que, apesar de uma maior expressão de SAMHD1, as TN apresentaram elevados níveis de DNA viral total e gag mRNA após 24h de infeção com isolados primários de VIH-2 ou VIH-1, independentemente do coreceptor utilizado. Tanto VIH-1 como VIH-2 conseguem infetar TN e Tfh, indiciando uma ausência de vantagem para o VIH-2 no combate ao SAMHD1. Todavia, os níveis de DNA viral total foram superiores nas Tfh, para ambas as infeções, o que está de acordo com o descrito na literatura. Apesar dos níveis baixos de SAMHD1 em Tfh em comparação com TN, verificámos que existe uma heterogeneidade da expressão de SAMHD1 em células que expressam CXCR5, que não aparenta estar relacionada com a expressão de nenhum marcador característico das Tfh, nomeadamente Bcl-6, OX40, e CD57. Para avaliar se a infeção pelo VIH-2, e consequentemente a diminuição de SAMHD1 por Vpx, tem impacto na produção de Tfh, realizámos um ensaio com base num protocolo previamente padronizado para a diferenciação in vitro de Tfh. Para isso, células T CD4 naïve isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico foram estimuladas e mantidas em cultura com um cocktail de citocinas para promover a diferenciação das Tfh. Estas células foram infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com duplo tropismo para CXCR4 e CCR5, de forma a contornar qualquer viés induzido pelo tropismo para um determinado coreceptor. Realizámos fenotipagem por citometria fluxo e recolhemos cell pellets para PCR quantitativo em diferentes dias de cultura. Surpreendentemente, a frequência das Tfh geradas demonstraram-se semelhantes após infeção com VIH-2 e VIH-1, bem como quando comparadas com o controlo não infetado. Mais, as Tfh geradas neste protocolo apresentam expressão semelhante de diversos marcadores associados às Tfh, indicando um fenótipo similar independentemente da condição de infeção (VIH-2, VIH-1 ou o controlo não infetado). Concluindo, o VIH-2, apesar de hospedar a Vpx, não apresentou vantagem significativa em infetar células T CD4 amigdalinas humanas, independentemente dos seus níveis distintos de SAMHD1. Para além disso, a infeção pelo VIH-2 não modulou a quantidade ou a qualidade das células Tfh geradas com o protocolo diferenciação in vitro de Tfh. Estes primeiros dados utilizando isolados primários de VIH-2 incentivam a investigação de mecanismos adicionais no estabelecimento de reservatórios Tfh, bem como as suas implicações na infeção por VIH-2.