Publicação

Visualization of STAT3 dimers in living cells

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A via de sinalização JAK/STAT3 (do inglês Janus Kinase/ Signal transducer and activator of transcription 3) é uma via intracelular envolvida em múltiplos processos relacionados com crescimento celular, diferenciação, proliferação e apoptose. Esta é também a via canónica envolvida em processos de diferenciação de astrócitos e responsável pela formação da cicatriz glial devido a lesões do sistema nervoso. A ativação desta via de sinalização inicia-se com a ligação de hormonas, fatores de crescimento ou citoquinas ao seu respetivo recetor, induzindo uma mudança conformacional no mesmo. Para o sinal ser propagado, as subunidades citoplasmáticas do recetor têm de estar ligadas a JAKs. As JAKs possuem domínios cinase no seu C-terminal, que trans-fosforilam o recetor e providenciam locais para a ligação de STAT3. As JAKs fosforilam também STAT3 em resíduos específicos de tirosina (Tirosina705). O paradigma original desta via de sinalização indicava que STAT3 dimerizava apenas quando fosforilado. No entanto, existem evidências recentes de que este fator de transcrição já se encontra na forma de dímeros estáveis no citoplasma. O passo final da via de sinalização é a translocação dos dímeros fosforilados para o núcleo e a sua ligação a sequências específicas em genes alvo, denominadas de SREs (do inglês STAT3-responsive elements). A JAK/STAT3 pode ser ativada pela ligação a diferentes tipos de recetores, incluindo recetores sem atividade tirosina cinase, recetores com atividade tirosina cinase ou recetores acoplados a proteína G. Na via de sinalização clássica, as citoquinas ligam-se a recetores sem atividade tirosina cinase. Entre estes recetores, os recetores da família gp130 (glicoproteína 130) são os de maior interesse para este trabalho, visto que o sinal mediado pela gp130 induz a diferenciação de astrócitos pela JAK/STAT3. A transdução através da JAK/STAT3 é realizada por uma série de fosforilações e interações entre proteínas, pelo que para o estudo de todos os passos da mesma é necessário a identificação de interações proteína-proteína especificas. Os métodos mais correntes envolvem danos para as células vivas. Deste modo, utilizámos o método de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC, das siglas em inglês) para o estudo da via de sinalização JAK/STAT3 em células vivas. O sistema Venus-STAT3 BiFC utilizado baseia-se na ligação de dois fragmentos não-fluorescentes da proteína fluorescente Venus a STAT3. Quando STAT3 dimeriza, as duas metades de Venus ficam suficientemente próximas reconstruindo o fluoróforo, e ocorre fluorescência. Esta fluorescência foi medida por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Para aferir a funcionalidade do sistema, testámos o comportamento dos dois construtos do sistema Venus-STAT3 BiFC (V1-STAT3 e V2-STAT3) em células vivas. A fluorescência ocorreu apenas nas células transfetadas com os dois construtos, demonstrando que a dimerização de STAT3 ocorre de forma espontânea. Em trabalhos anteriores a este, foi demonstrado que STAT3 não dimerizou com outras proteínas que continham a metade complementar da proteína Venus. Estes dados sugerem que a fluorescência é específica e indicativa da dimerização espontânea de STAT3 inativo. Estudámos também o comportamento dos dímeros de STAT3 face a estímulos com citocinas. Verificámos que nas células estimuladas, há translocação de toda a fluorescência para o núcleo. No entanto, não se observou nenhum aumento do número de dímeros nas células estimuladas. Estudámos também um inibidor de STAT3, denominado Stattic. Na presença deste inibidor, verificámos uma diminuição do número de dímeros, para além de uma inibição da ativação da proteína (por inibição da fosforilação no resíduo Tirosina705) e da translocação para o núcleo. Visto que o sistema Venus-STAT3 BiFC conferiu informação direta sobre a dimerização e translocação de STAT3 para o núcleo, decidimos realizar rastreios moleculares. Testámos uma série de complexos dinuclares macrocíclicos, sintetizados pelo grupo da Drª Rita Delgado (ITQB-NOVA, Lisboa). Encontrámos 3 complexos macrocíclicos de zinco, com capacidade de inibir a fosforilação de STAT3 e a sua translocação para o núcleo. Neste momento, estamos ainda a realizar testes para confirmar estes resultados e para melhor compreender qual o mecanismo pelo qual ocorre esta inibição. Visto que a fosforilação é um evento tão importante na ativação da JAK/STAT3, pretendíamos determinar se outras vias de fosforilação tinham um papel determinante na dimerização espontânea de STAT3. Para isso, realizámos também um rastreio molecular numa libraria de inibidores de cinases. De uma parte desta libraria testada durante a realização deste trabalho, encontrámos um composto que inibiu a dimerização de STAT3. Na restante libraria, existe um outro inibidor que tem a mesma cinase como alvo. Neste momento, existem outros colegas de laboratório a testar este composto. O sistema Venus-STAT3 BiFC usado neste trabalho mostrou ser uma ferramenta muito útil no estudo da dimerização e translocação nuclear de STAT3. Para além de ser utilizado como uma ferramenta para análise de possíveis moduladores farmacológicos da JAK/STAT3, permite também descobrir novos intervenientes desta via. Fora do contexto desta via de sinalização, é um sistema que pode ser usado para o estudo de interação de inúmeras outras proteínas e em diferentes contextos biológicos.
Autores principais:	Almeida, Ana Catarina da Silva
Assunto:	via de sinalização JAK/STAT3 STAT3 astrogliogénese BiFC Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A via de sinalização JAK/STAT3 (do inglês Janus Kinase/ Signal transducer and activator of transcription 3) é uma via intracelular envolvida em múltiplos processos relacionados com crescimento celular, diferenciação, proliferação e apoptose. Esta é também a via canónica envolvida em processos de diferenciação de astrócitos e responsável pela formação da cicatriz glial devido a lesões do sistema nervoso. A ativação desta via de sinalização inicia-se com a ligação de hormonas, fatores de crescimento ou citoquinas ao seu respetivo recetor, induzindo uma mudança conformacional no mesmo. Para o sinal ser propagado, as subunidades citoplasmáticas do recetor têm de estar ligadas a JAKs. As JAKs possuem domínios cinase no seu C-terminal, que trans-fosforilam o recetor e providenciam locais para a ligação de STAT3. As JAKs fosforilam também STAT3 em resíduos específicos de tirosina (Tirosina705). O paradigma original desta via de sinalização indicava que STAT3 dimerizava apenas quando fosforilado. No entanto, existem evidências recentes de que este fator de transcrição já se encontra na forma de dímeros estáveis no citoplasma. O passo final da via de sinalização é a translocação dos dímeros fosforilados para o núcleo e a sua ligação a sequências específicas em genes alvo, denominadas de SREs (do inglês STAT3-responsive elements). A JAK/STAT3 pode ser ativada pela ligação a diferentes tipos de recetores, incluindo recetores sem atividade tirosina cinase, recetores com atividade tirosina cinase ou recetores acoplados a proteína G. Na via de sinalização clássica, as citoquinas ligam-se a recetores sem atividade tirosina cinase. Entre estes recetores, os recetores da família gp130 (glicoproteína 130) são os de maior interesse para este trabalho, visto que o sinal mediado pela gp130 induz a diferenciação de astrócitos pela JAK/STAT3. A transdução através da JAK/STAT3 é realizada por uma série de fosforilações e interações entre proteínas, pelo que para o estudo de todos os passos da mesma é necessário a identificação de interações proteína-proteína especificas. Os métodos mais correntes envolvem danos para as células vivas. Deste modo, utilizámos o método de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC, das siglas em inglês) para o estudo da via de sinalização JAK/STAT3 em células vivas. O sistema Venus-STAT3 BiFC utilizado baseia-se na ligação de dois fragmentos não-fluorescentes da proteína fluorescente Venus a STAT3. Quando STAT3 dimeriza, as duas metades de Venus ficam suficientemente próximas reconstruindo o fluoróforo, e ocorre fluorescência. Esta fluorescência foi medida por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Para aferir a funcionalidade do sistema, testámos o comportamento dos dois construtos do sistema Venus-STAT3 BiFC (V1-STAT3 e V2-STAT3) em células vivas. A fluorescência ocorreu apenas nas células transfetadas com os dois construtos, demonstrando que a dimerização de STAT3 ocorre de forma espontânea. Em trabalhos anteriores a este, foi demonstrado que STAT3 não dimerizou com outras proteínas que continham a metade complementar da proteína Venus. Estes dados sugerem que a fluorescência é específica e indicativa da dimerização espontânea de STAT3 inativo. Estudámos também o comportamento dos dímeros de STAT3 face a estímulos com citocinas. Verificámos que nas células estimuladas, há translocação de toda a fluorescência para o núcleo. No entanto, não se observou nenhum aumento do número de dímeros nas células estimuladas. Estudámos também um inibidor de STAT3, denominado Stattic. Na presença deste inibidor, verificámos uma diminuição do número de dímeros, para além de uma inibição da ativação da proteína (por inibição da fosforilação no resíduo Tirosina705) e da translocação para o núcleo. Visto que o sistema Venus-STAT3 BiFC conferiu informação direta sobre a dimerização e translocação de STAT3 para o núcleo, decidimos realizar rastreios moleculares. Testámos uma série de complexos dinuclares macrocíclicos, sintetizados pelo grupo da Drª Rita Delgado (ITQB-NOVA, Lisboa). Encontrámos 3 complexos macrocíclicos de zinco, com capacidade de inibir a fosforilação de STAT3 e a sua translocação para o núcleo. Neste momento, estamos ainda a realizar testes para confirmar estes resultados e para melhor compreender qual o mecanismo pelo qual ocorre esta inibição. Visto que a fosforilação é um evento tão importante na ativação da JAK/STAT3, pretendíamos determinar se outras vias de fosforilação tinham um papel determinante na dimerização espontânea de STAT3. Para isso, realizámos também um rastreio molecular numa libraria de inibidores de cinases. De uma parte desta libraria testada durante a realização deste trabalho, encontrámos um composto que inibiu a dimerização de STAT3. Na restante libraria, existe um outro inibidor que tem a mesma cinase como alvo. Neste momento, existem outros colegas de laboratório a testar este composto. O sistema Venus-STAT3 BiFC usado neste trabalho mostrou ser uma ferramenta muito útil no estudo da dimerização e translocação nuclear de STAT3. Para além de ser utilizado como uma ferramenta para análise de possíveis moduladores farmacológicos da JAK/STAT3, permite também descobrir novos intervenientes desta via. Fora do contexto desta via de sinalização, é um sistema que pode ser usado para o estudo de interação de inúmeras outras proteínas e em diferentes contextos biológicos.