Publicação
Cell-specific functions of RIPK3 in the hepatic ecosystem of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD)
| Resumo: | A doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (DHEDM), anteriormente conhecida como doença de fígado gordo não-alcoólico (DFGNA), é a doença hepática crónica mais prevalente e está intimamente relacionada à síndrome metabólica (MetS). Apesar da sua elevada prevalência, a escassez de opções terapêuticas eficazes ressalta a necessidade de uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes à MASLD, para identificar novos alvos para intervenções terapêuticas racionais. A proteína receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) é um executor-chave da necroptose, uma forma de morte celular regulada implicada na patogénese da MASLD. RIPK3 também tem emergido como um regulador do metabolismo, mas o seu potencial terapêutico permanece incerto devido ao seu papel pouco claro em diferentes tipos celulares na patogénese da DHEDM. Este estudo teve como objetivo investigar o potencial terapêutico da inibição da RIPK3 na DHEDM, com foco nos seus efeitos específicos a nível celular sobre o metabolismo hepático de lipídios e glucose, na sinalização da insulina, inflamação e fibrose. Modelos 2D e 3D, incluindo monoculturas e co-culturas de hepatócitos murinos e humanos e células não parenquimatosas (CNPs), foram utilizadas para simular condições basais ou semelhantes a MetS. As condições de MetS foram induzidas expondo as células a concentrações elevadas de glucose, insulina e ácidos gordos livres (AGLs). Ensaios fenotípicos avaliaram a viabilidade celular, a acumulação de lípidos neutros, a captação de glucose e a deposição de colagénio, enquanto os alvos moleculares principais foram analisados por qPCR e imunoblotting. Os nossos resultados mostraram que, sob condições de simulação de MetS, a viabilidade dos hepatócitos não foi comprometida; em vez disso, a produção de ATP foi maior em hepatócitos murinos Ripk3-/- e esferoides de hepatócitos humanos primários (HHP) tratados com um inibidor farmacológico de RIPK3. Apesar dos níveis aumentados de mRNA de carnitina palmitoiltransferase I (Cpt1) e da diminuição da expressão de proteína de ligação do elemento de resposta aos carboidratos (Chrebp) e dos níveis de proteína acetil-CoA carboxilase (ACC) em hepatócitos Ripk3-/ - sob condições MetS, a acumulação de gordura e a expressão de outras enzimas de síntese de ácidos gordos não foram alteradas em comparação com células de tipo selvagem. Por outro lado, o silenciamento de RIPK3 e a inibição química com GSK'872 reduziram o conteúdo de lípidos neutros intracelulares após 1 semana de incubação com AGLs, com uma tendência semelhante no tratamento pós-esteatose de esferoides de HHP. No entanto, o efeito da inibição de RIPK3 na redução da acumulação lipídica em esferoides de HPP foi perdido após 2 semanas de incubação com AGLs, e apenas o tratamento com GSK'872 em doses mais elevadas reduziu a deposição de lípidos em esferoides de co-cultura. Os hepatócitos murinos deficientes em Ripk3 também mostraram uma melhoria na captação de glucose e ligeiro aumento expressão de glicose-6-fosfatase subunidade catalítica 1 (G6pc1) e fosfoenolpiruvato carboxiquinase 1 (Pck1) em resposta ao estímulo de MetS, embora esses efeitos tenham sido mitigados pela presença de macrófagos ativados. Enquanto o secretoma de hepatócitos Ripk3-/- não tenha impactado os marcadores pró-inflamatórios nos macrófagos, aumentou a expressão de arginase 1 (Arg1) nos macrófagos, sugerindo um possível papel anti-inflamatório. De facto, nos esferoides de co-cultura, a inibição de RIPK3 diminuiu a secreção de citocinas e quimiocinas sob stress metabólico, juntamente com uma redução na secreção de pro-colágeno1α1. Em conclusão, os nossos resultados lançam nova luz sobre o papel de RIPK3 no metabolismo dos hepatócitos e na sua interação com NPCs sob disfunção metabólica. A inibição de RIPK3 pode melhorar o metabolismo energético, reduzir a inflamação e mitigar a fibrose sob stress metabólico, destacando o seu potencial como alvo terapêutico na DHEDM. |
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| Autores principais: | Figueiredo, Rita Esteves |
| Assunto: | Metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) Metabolic syndrome Metabolism RIPK3 Inflammation Teses de mestrado - 2024 |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | A doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (DHEDM), anteriormente conhecida como doença de fígado gordo não-alcoólico (DFGNA), é a doença hepática crónica mais prevalente e está intimamente relacionada à síndrome metabólica (MetS). Apesar da sua elevada prevalência, a escassez de opções terapêuticas eficazes ressalta a necessidade de uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes à MASLD, para identificar novos alvos para intervenções terapêuticas racionais. A proteína receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) é um executor-chave da necroptose, uma forma de morte celular regulada implicada na patogénese da MASLD. RIPK3 também tem emergido como um regulador do metabolismo, mas o seu potencial terapêutico permanece incerto devido ao seu papel pouco claro em diferentes tipos celulares na patogénese da DHEDM. Este estudo teve como objetivo investigar o potencial terapêutico da inibição da RIPK3 na DHEDM, com foco nos seus efeitos específicos a nível celular sobre o metabolismo hepático de lipídios e glucose, na sinalização da insulina, inflamação e fibrose. Modelos 2D e 3D, incluindo monoculturas e co-culturas de hepatócitos murinos e humanos e células não parenquimatosas (CNPs), foram utilizadas para simular condições basais ou semelhantes a MetS. As condições de MetS foram induzidas expondo as células a concentrações elevadas de glucose, insulina e ácidos gordos livres (AGLs). Ensaios fenotípicos avaliaram a viabilidade celular, a acumulação de lípidos neutros, a captação de glucose e a deposição de colagénio, enquanto os alvos moleculares principais foram analisados por qPCR e imunoblotting. Os nossos resultados mostraram que, sob condições de simulação de MetS, a viabilidade dos hepatócitos não foi comprometida; em vez disso, a produção de ATP foi maior em hepatócitos murinos Ripk3-/- e esferoides de hepatócitos humanos primários (HHP) tratados com um inibidor farmacológico de RIPK3. Apesar dos níveis aumentados de mRNA de carnitina palmitoiltransferase I (Cpt1) e da diminuição da expressão de proteína de ligação do elemento de resposta aos carboidratos (Chrebp) e dos níveis de proteína acetil-CoA carboxilase (ACC) em hepatócitos Ripk3-/ - sob condições MetS, a acumulação de gordura e a expressão de outras enzimas de síntese de ácidos gordos não foram alteradas em comparação com células de tipo selvagem. Por outro lado, o silenciamento de RIPK3 e a inibição química com GSK'872 reduziram o conteúdo de lípidos neutros intracelulares após 1 semana de incubação com AGLs, com uma tendência semelhante no tratamento pós-esteatose de esferoides de HHP. No entanto, o efeito da inibição de RIPK3 na redução da acumulação lipídica em esferoides de HPP foi perdido após 2 semanas de incubação com AGLs, e apenas o tratamento com GSK'872 em doses mais elevadas reduziu a deposição de lípidos em esferoides de co-cultura. Os hepatócitos murinos deficientes em Ripk3 também mostraram uma melhoria na captação de glucose e ligeiro aumento expressão de glicose-6-fosfatase subunidade catalítica 1 (G6pc1) e fosfoenolpiruvato carboxiquinase 1 (Pck1) em resposta ao estímulo de MetS, embora esses efeitos tenham sido mitigados pela presença de macrófagos ativados. Enquanto o secretoma de hepatócitos Ripk3-/- não tenha impactado os marcadores pró-inflamatórios nos macrófagos, aumentou a expressão de arginase 1 (Arg1) nos macrófagos, sugerindo um possível papel anti-inflamatório. De facto, nos esferoides de co-cultura, a inibição de RIPK3 diminuiu a secreção de citocinas e quimiocinas sob stress metabólico, juntamente com uma redução na secreção de pro-colágeno1α1. Em conclusão, os nossos resultados lançam nova luz sobre o papel de RIPK3 no metabolismo dos hepatócitos e na sua interação com NPCs sob disfunção metabólica. A inibição de RIPK3 pode melhorar o metabolismo energético, reduzir a inflamação e mitigar a fibrose sob stress metabólico, destacando o seu potencial como alvo terapêutico na DHEDM. |
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