Publicação

Modeling neuropathological type II Gaucher Disease using iPSCs, CRISPR/Cas9 and transcription factor-driven protocols

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A Doença de Gaucher (GD) é uma patologia com transmissão hereditária autossómica recessiva causada por mutações no gene GBA1 que codifica para o enzima beta-glucocerebrosidase (GCase). Esta proteína é um enzima housekeeping nos lisossomas, responsável pela degradação de glucocerebrosidase em glicose e ceramida. Com uma incidência entre 1 em 40.000 e 1 em 60.000 nascimentos na população geral, e 1 em 800 nascimentos na população de descendência Judaica Ashkenazi, é a forma mais comum de Doença Lisossomal de Sobrecarga. Estão descritas mais de 495 mutações no gene GBA1, sendo as mais comuns mutações missense que levam à produção de proteínas misfolded. Em homozigotia ou em heterozigotia composta, certas mutações levam à manifestação de fenótipos mais severos com envolvimento neurológico, em que a atividade da GCase é quase nula, classificado como GD do tipo 2. Independentemente do nível de manifestação da doença, as mutações no gene GBA1 estão associadas a um maior risco de desenvolvimento de Doença de Parkinson e Demência de Corpos de Lewy, através de mecanismos ainda desconhecidos, mas muito provavelmente relacionados com a degradação ineficiente de proteínas, nomeadamente α-sinucleína, em células com funcionamento lisossomal comprometido. Modelos animais têm sido gerados para o estudo de GD, e, embora bastante úteis para as manifestações somáticas desta patologia, o envolvimento neurológico tem sido muito limitado nestes modelos e as mutações induzidas em homozigotia levam a fenótipos agressivos em que os animais não sobrevivem muito tempo após o nascimento, pelo que a sua aplicação no contexto de GD do tipo 2 é bastante insuficiente. Neste sentido, as iPSCs produzidas através da reprogramação direta de células somáticas humanas obtidas de pacientes, a um estadio de pluripotência via o método desenvolvido por Yamanaka, et al, surgem como um possível modelo in vitro, possibilitando o estudo de diversas patologias. Através de métodos de edição genética como CRISPR/Cas9 e da sua otimização nos últimos anos, é possível a introdução, deleção ou correção de mutações nestes modelos celulares, de forma a replicar doenças hereditárias ou obter controlos isogénicos que permitem o seu estudo de forma fidedigna. Inicialmente neste projeto, caracterizámos células iPSCs provenientes de três pacientes com a forma mais severa e com manifestações neuropáticas de GD tipo 2. Através de RT-qPRC, da formação de corpos embrionários e cariotipagem, demonstrámos a estabilidade cromossómica nas amostras em estudo e o seu estado de pluripotência através da expressão de genes como NANOG, SOX2 e OCT4 (POU5F1), bem como a posterior diferenciação dos corpos embrionários nos três folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme. Seguidamente, trabalhámos na otimização de protocolos de edição genética com CRISPR/Cas9 com o intuito de corrigir as mutações missense de substituição de bases no gene GBA1 das amostras em estudo, de forma a obter controlos isogénicos e, através da sobre-expressão de fatores de transcrição, induzimos a diferenciação das iPSCs em neurónios e astrócitos. Finalmente, demonstrámos níveis significativamente reduzidos de atividade enzimática da GCase nas linhas mutadas e alteração do funcionamento dos lisossomas, quando comparadas a controlos wild type e ao controlo isogénico e função lisossomal alterada, nas amostras de GD tipo 2. De uma forma geral, este estudo demonstrou o potencial significativo da utilização de células iPSCs como modelos in vitro de GD, particularmente da forma neuropática, em que a obtenção dos tipos celulares afetados é particularmente difícil e não existem, até à data desta dissertação, modelos animais que repliquem este fenótipo.
Autores principais:	Sãcultanu, Mãdãlina
Assunto:	(LSDs) Doença Lisossomal de Sobrecarga (GD) Doença de Gaucher (GCase) beta-glucocerebrosidase (iPSCs) Células Estamiais Pluripotentes induzidas CRISPR/Cas9 Teses de mestrado - 2020
Ano:	2020
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A Doença de Gaucher (GD) é uma patologia com transmissão hereditária autossómica recessiva causada por mutações no gene GBA1 que codifica para o enzima beta-glucocerebrosidase (GCase). Esta proteína é um enzima housekeeping nos lisossomas, responsável pela degradação de glucocerebrosidase em glicose e ceramida. Com uma incidência entre 1 em 40.000 e 1 em 60.000 nascimentos na população geral, e 1 em 800 nascimentos na população de descendência Judaica Ashkenazi, é a forma mais comum de Doença Lisossomal de Sobrecarga. Estão descritas mais de 495 mutações no gene GBA1, sendo as mais comuns mutações missense que levam à produção de proteínas misfolded. Em homozigotia ou em heterozigotia composta, certas mutações levam à manifestação de fenótipos mais severos com envolvimento neurológico, em que a atividade da GCase é quase nula, classificado como GD do tipo 2. Independentemente do nível de manifestação da doença, as mutações no gene GBA1 estão associadas a um maior risco de desenvolvimento de Doença de Parkinson e Demência de Corpos de Lewy, através de mecanismos ainda desconhecidos, mas muito provavelmente relacionados com a degradação ineficiente de proteínas, nomeadamente α-sinucleína, em células com funcionamento lisossomal comprometido. Modelos animais têm sido gerados para o estudo de GD, e, embora bastante úteis para as manifestações somáticas desta patologia, o envolvimento neurológico tem sido muito limitado nestes modelos e as mutações induzidas em homozigotia levam a fenótipos agressivos em que os animais não sobrevivem muito tempo após o nascimento, pelo que a sua aplicação no contexto de GD do tipo 2 é bastante insuficiente. Neste sentido, as iPSCs produzidas através da reprogramação direta de células somáticas humanas obtidas de pacientes, a um estadio de pluripotência via o método desenvolvido por Yamanaka, et al, surgem como um possível modelo in vitro, possibilitando o estudo de diversas patologias. Através de métodos de edição genética como CRISPR/Cas9 e da sua otimização nos últimos anos, é possível a introdução, deleção ou correção de mutações nestes modelos celulares, de forma a replicar doenças hereditárias ou obter controlos isogénicos que permitem o seu estudo de forma fidedigna. Inicialmente neste projeto, caracterizámos células iPSCs provenientes de três pacientes com a forma mais severa e com manifestações neuropáticas de GD tipo 2. Através de RT-qPRC, da formação de corpos embrionários e cariotipagem, demonstrámos a estabilidade cromossómica nas amostras em estudo e o seu estado de pluripotência através da expressão de genes como NANOG, SOX2 e OCT4 (POU5F1), bem como a posterior diferenciação dos corpos embrionários nos três folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme. Seguidamente, trabalhámos na otimização de protocolos de edição genética com CRISPR/Cas9 com o intuito de corrigir as mutações missense de substituição de bases no gene GBA1 das amostras em estudo, de forma a obter controlos isogénicos e, através da sobre-expressão de fatores de transcrição, induzimos a diferenciação das iPSCs em neurónios e astrócitos. Finalmente, demonstrámos níveis significativamente reduzidos de atividade enzimática da GCase nas linhas mutadas e alteração do funcionamento dos lisossomas, quando comparadas a controlos wild type e ao controlo isogénico e função lisossomal alterada, nas amostras de GD tipo 2. De uma forma geral, este estudo demonstrou o potencial significativo da utilização de células iPSCs como modelos in vitro de GD, particularmente da forma neuropática, em que a obtenção dos tipos celulares afetados é particularmente difícil e não existem, até à data desta dissertação, modelos animais que repliquem este fenótipo.