Publicação

Analysis of signalling pathways required for hemocyte navigation in Drosphila

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.
Autores principais:	Brandão, Ana Sofia da Silva Pereira
Assunto:	Biologia do desenvolvimento Drosophila melanogaster Migração celular Teses de mestrado - 2011
Ano:	2011
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.