Publicação

Investigating BDNF receptor cleavage in an in vivo model of epilepsy

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A epilepsia é uma perturbação cerebral caracterizada pela predisposição para gerar crises espontâneas recorrentes. A sincronização repentina e temporária da atividade neuronal devido a um desequilíbrio entre a neurotransmissão inibitória, mediada pelo GABA, e excitatória, mediada pelo glutamato, é o mecanismo responsável pelas crises. Trata-se de uma doença com elevada prevalência, afetando cerca de 50 milhões de pessoas, no entanto, cerca de 30% dos doentes sofrem de epilepsia refratária à terapêutica farmacológica, necessitando de recorrer a estratégias mais invasivas para o controlo sintomático da doença. Segundo a mais recente classificação da ILAE, esta patologia é categorizada em generalizada, focal e com início desconhecido. A variante mais frequente de epilepsia focal em seres humanos é a epilepsia do lobo temporal, acometendo principalmente o hipocampo. A epileptogénese é o processo pelo qual um cérebro saudável, após um insulto, desenvolve crises espontâneas. No entanto, há necessidade de esclarecer a fisiopatologia deste processo para a criação de novas estratégias terapêuticas. As mudanças na fisiologia do cérebro, como as alterações na sinalização do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e do seu recetor de tropomiosina B (TrkB-FL) contribuem para a fisiopatologia desta doença. O BDNF é responsável por processos de neuroprotecção endógena, tais como a sobrevivência neuronal e a neurogénese. Na presença de condições excitotóxicas, os recetores TrkB-FL são clivados por calpaínas dando origem a um recetor truncado, TrkB-T’, e a um fragmento intracelular, TrkB-ICD, comprometendo, assim, as ações neuroprotetoras do BDNF. Num modelo in vitro de status epilepticus (SE) foi demonstrado níveis diminuídos de TrkB-FL e níveis aumentados de TrkB-T’, o que sugere que o recetor é clivado nestas condições de SE. Já foi demonstrado que níveis elevados de BDNF num contexto pós crise, pode induzir uma forma aberrante de neurogénese e a dispersão das fibras musgosas. Além disso, previamente, um estudo recente revelou que o TrkB-ICD é uma proteína capaz de se deslocar até ao núcleo da célula e fosforilar diversas proteínas, alterando, desta forma a expressão génica no contexto da epilepsia. Estudos in vitro, in vivo e ex vivo, num contexto de doença de Alzheimer, revelaram a capacidade do TAT-TrkB em inibir a clivagem do TrkB-FL e de restaurar a sinalização BDNF/TrkB. No entanto, a caracterização da clivagem do TrkB-FL no modelo in vivo e a formação e função do TrkB-ICD continuam por esclarecer na epilepsia. O principal objetivo desta tese foi compreender o mecanismo pelo qual o BDNF está implicado na epileptogénese e perceber o papel da clivagem do TrkB-FL e a sua modulação num modelo experimental de epilepsia. De forma a desenvolver um modelo experimental, ratos Sprague-Dawley machos com 7 semanas foram injetados com kainato (KA) (10 mg/kg, intraperitoneal, ip). O modelo de epilepsia induzida por KA revelou ter sido bem estabelecido, uma vez que permitiu a ocorrência de crises espontâneas após 4 semanas da sua administração. Para o estudo da clivagem do TrkB-FL foram formados dois grupos: 1) animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA e que apenas tiveram SE; 2) animais sacrificados 4 semanas após o KA e que desenvolveram epilepsia. Os animais controlo foram injetados com solução salina. As crises foram caracterizadas utilizando a Escala de Racine Modificada. Neste estudo, a proliferação neuronal foi avaliada através da coloração com Ki67, os neurónios hipocampais foram avaliados através do NeuN e a dispersão das fibras musgosas foi avaliada através da sinaptoporina. Para estudar o impacto da modulação na sinalização BDNF/TrkB, foram criados quatro grupos: 1) controlo; 2) TAT-TrkB; 3) KA, e 4) TAT-TrkB+KA. Todos os grupos foram sacrificados 3-4 horas após a última administração, durante o SE. Ao avaliar os hipocampos dos animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA, foi possível observar uma diminuição significativa dos níveis proteicos de TrkB-FL e uma tendência para o aumento do rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, o que sugere uma possível clivagem do TrkBFL nestes animais, quando comparados com os animais controlo. É importante ressalvar que, nos animais em SE foi possível observar um efeito positivo dos níveis proteicos de TrkB-ICD no número de crises nestes animais. No entanto, nos ratos com epilepsia estabelecida, não foi observado uma diminuição significativa nos níveis de TrkB-FL ou aumento da relação TrkB-ICD/TrkB-FL, sugerindo que essa clivagem pode não ocorrer durante a progressão da epilepsia. No entanto, pela limitação do número de animais, no futuro este número será aumentado e os animais serão segregados segundo a gravidade das crises, permitindo uma análise mais detalhada do papel da clivagem do TrkB-FL na epilepsia. Com base nos resultados obtidos, pode-se especular que a sinalização do BDNF/TrkB exerce um efeito epileptogénico nas fases iniciais desta doença, no entanto, não se perpetua durante a progressão da mesma. Quanto à análise de imunohistoquímica, foi observado um aumento da proliferação neuronal em animais mais jovens, independentemente da sua condição. No entanto, os animais com epilepsia estabelecida tendem a ter um volume maior do hipocampo, possivelmente relacionado com a dispersão das células granulares no Girus Dentado (DG). No futuro, a neurogénese deverá ser avaliada em diferentes pontos no tempo. Análises qualitativas de coloração de NeuN em animais com epilepsia estabelecida revelaram uma perda de imunoreactividade, sugestiva de neurodegeneração, e uma dispersão da camada granular do DG. Além disso, foi observada uma maior imunoreatividade à sinaptoporina no DG nestes animais, o que sugere a dispersão das fibras musgosas. Ao avaliar a modulação da clivagem do TrkB-FL usando o TAT-TrkB, foi possível observar que os animais tratados com KA apresentaram uma diminuição significativa nos níveis de proteína TrkB-FL, no entanto os animais injetados com TAT-TrkB 24 horas antes do KA não mostraram diferenças em comparação com os animais tratados com KA. Desta forma, o TAT-TrkB não foi capaz de prevenir a diminuição dos níveis de TrkBFL em animais com SE. A variabilidade entre os animais tratados com KA, que apresentam diferentes graus de gravidade das crises, o processo de degradação do TrkB-ICD, juntamente com o número baixo de animais, pode explicar a falta de diferenças nos níveis de proteína TrkBICD e na relação TrkB-ICD/TrkB-FL. Globalmente, este estudo oferece uma nova perspetiva sobre a fisiopatologia da epilepsia, ao sugerir que a clivagem do TrkB-FL contribui para a epileptogénese num modelo in vivo de epilepsia. Além disso, estabeleceu uma correlação entre o fragmento TrkB-ICD e a frequência de crises. Estes resultados são o primeiro passo para a identificação de novos alvos terapêuticos na epilepsia refratária.
Autores principais:	Correia, Diana Sousa
Assunto:	Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Receptor trkB Neurogénese Epilepsia
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A epilepsia é uma perturbação cerebral caracterizada pela predisposição para gerar crises espontâneas recorrentes. A sincronização repentina e temporária da atividade neuronal devido a um desequilíbrio entre a neurotransmissão inibitória, mediada pelo GABA, e excitatória, mediada pelo glutamato, é o mecanismo responsável pelas crises. Trata-se de uma doença com elevada prevalência, afetando cerca de 50 milhões de pessoas, no entanto, cerca de 30% dos doentes sofrem de epilepsia refratária à terapêutica farmacológica, necessitando de recorrer a estratégias mais invasivas para o controlo sintomático da doença. Segundo a mais recente classificação da ILAE, esta patologia é categorizada em generalizada, focal e com início desconhecido. A variante mais frequente de epilepsia focal em seres humanos é a epilepsia do lobo temporal, acometendo principalmente o hipocampo. A epileptogénese é o processo pelo qual um cérebro saudável, após um insulto, desenvolve crises espontâneas. No entanto, há necessidade de esclarecer a fisiopatologia deste processo para a criação de novas estratégias terapêuticas. As mudanças na fisiologia do cérebro, como as alterações na sinalização do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e do seu recetor de tropomiosina B (TrkB-FL) contribuem para a fisiopatologia desta doença. O BDNF é responsável por processos de neuroprotecção endógena, tais como a sobrevivência neuronal e a neurogénese. Na presença de condições excitotóxicas, os recetores TrkB-FL são clivados por calpaínas dando origem a um recetor truncado, TrkB-T’, e a um fragmento intracelular, TrkB-ICD, comprometendo, assim, as ações neuroprotetoras do BDNF. Num modelo in vitro de status epilepticus (SE) foi demonstrado níveis diminuídos de TrkB-FL e níveis aumentados de TrkB-T’, o que sugere que o recetor é clivado nestas condições de SE. Já foi demonstrado que níveis elevados de BDNF num contexto pós crise, pode induzir uma forma aberrante de neurogénese e a dispersão das fibras musgosas. Além disso, previamente, um estudo recente revelou que o TrkB-ICD é uma proteína capaz de se deslocar até ao núcleo da célula e fosforilar diversas proteínas, alterando, desta forma a expressão génica no contexto da epilepsia. Estudos in vitro, in vivo e ex vivo, num contexto de doença de Alzheimer, revelaram a capacidade do TAT-TrkB em inibir a clivagem do TrkB-FL e de restaurar a sinalização BDNF/TrkB. No entanto, a caracterização da clivagem do TrkB-FL no modelo in vivo e a formação e função do TrkB-ICD continuam por esclarecer na epilepsia. O principal objetivo desta tese foi compreender o mecanismo pelo qual o BDNF está implicado na epileptogénese e perceber o papel da clivagem do TrkB-FL e a sua modulação num modelo experimental de epilepsia. De forma a desenvolver um modelo experimental, ratos Sprague-Dawley machos com 7 semanas foram injetados com kainato (KA) (10 mg/kg, intraperitoneal, ip). O modelo de epilepsia induzida por KA revelou ter sido bem estabelecido, uma vez que permitiu a ocorrência de crises espontâneas após 4 semanas da sua administração. Para o estudo da clivagem do TrkB-FL foram formados dois grupos: 1) animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA e que apenas tiveram SE; 2) animais sacrificados 4 semanas após o KA e que desenvolveram epilepsia. Os animais controlo foram injetados com solução salina. As crises foram caracterizadas utilizando a Escala de Racine Modificada. Neste estudo, a proliferação neuronal foi avaliada através da coloração com Ki67, os neurónios hipocampais foram avaliados através do NeuN e a dispersão das fibras musgosas foi avaliada através da sinaptoporina. Para estudar o impacto da modulação na sinalização BDNF/TrkB, foram criados quatro grupos: 1) controlo; 2) TAT-TrkB; 3) KA, e 4) TAT-TrkB+KA. Todos os grupos foram sacrificados 3-4 horas após a última administração, durante o SE. Ao avaliar os hipocampos dos animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA, foi possível observar uma diminuição significativa dos níveis proteicos de TrkB-FL e uma tendência para o aumento do rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, o que sugere uma possível clivagem do TrkBFL nestes animais, quando comparados com os animais controlo. É importante ressalvar que, nos animais em SE foi possível observar um efeito positivo dos níveis proteicos de TrkB-ICD no número de crises nestes animais. No entanto, nos ratos com epilepsia estabelecida, não foi observado uma diminuição significativa nos níveis de TrkB-FL ou aumento da relação TrkB-ICD/TrkB-FL, sugerindo que essa clivagem pode não ocorrer durante a progressão da epilepsia. No entanto, pela limitação do número de animais, no futuro este número será aumentado e os animais serão segregados segundo a gravidade das crises, permitindo uma análise mais detalhada do papel da clivagem do TrkB-FL na epilepsia. Com base nos resultados obtidos, pode-se especular que a sinalização do BDNF/TrkB exerce um efeito epileptogénico nas fases iniciais desta doença, no entanto, não se perpetua durante a progressão da mesma. Quanto à análise de imunohistoquímica, foi observado um aumento da proliferação neuronal em animais mais jovens, independentemente da sua condição. No entanto, os animais com epilepsia estabelecida tendem a ter um volume maior do hipocampo, possivelmente relacionado com a dispersão das células granulares no Girus Dentado (DG). No futuro, a neurogénese deverá ser avaliada em diferentes pontos no tempo. Análises qualitativas de coloração de NeuN em animais com epilepsia estabelecida revelaram uma perda de imunoreactividade, sugestiva de neurodegeneração, e uma dispersão da camada granular do DG. Além disso, foi observada uma maior imunoreatividade à sinaptoporina no DG nestes animais, o que sugere a dispersão das fibras musgosas. Ao avaliar a modulação da clivagem do TrkB-FL usando o TAT-TrkB, foi possível observar que os animais tratados com KA apresentaram uma diminuição significativa nos níveis de proteína TrkB-FL, no entanto os animais injetados com TAT-TrkB 24 horas antes do KA não mostraram diferenças em comparação com os animais tratados com KA. Desta forma, o TAT-TrkB não foi capaz de prevenir a diminuição dos níveis de TrkBFL em animais com SE. A variabilidade entre os animais tratados com KA, que apresentam diferentes graus de gravidade das crises, o processo de degradação do TrkB-ICD, juntamente com o número baixo de animais, pode explicar a falta de diferenças nos níveis de proteína TrkBICD e na relação TrkB-ICD/TrkB-FL. Globalmente, este estudo oferece uma nova perspetiva sobre a fisiopatologia da epilepsia, ao sugerir que a clivagem do TrkB-FL contribui para a epileptogénese num modelo in vivo de epilepsia. Além disso, estabeleceu uma correlação entre o fragmento TrkB-ICD e a frequência de crises. Estes resultados são o primeiro passo para a identificação de novos alvos terapêuticos na epilepsia refratária.