Publicação

Clonagem e caracterização de sistemas de restrição e modificação do tipo IIG de Epsilonproteobacteria em Escherichia coli

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os sistemas de restrição e modificação (RM) são sistemas enzimáticos não vitais, de complexidade variável, ubiquitários em Bacteria e Archaea. Actualmente considera-se que existam quatro grandes tipos e vários subtipos. Alguns dos géneros que pertencem à ordem Campylobacterales, nomeadamente Helicobacter e Campylobacter, têm uma característica pouco frequente, a presença de um elevado número de sistemas RM putativos no seu genoma. Analisaram-se os trinta e um genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie H. pylori e os nove genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie C. jejuni, anotados na REBASE (restriction enzyme database), e verificou-se que os sistemas RM não se encontram distribuídos ao acaso pelo genoma, localizando-se em loci bem definidos. A análise focou-se nos sistemas RM do tipo IIG e tendo as estirpes H. pylori 26695 e C. jejuni RM1221 como modelo, encontraram-se quatro loci em cada uma delas. Foram desenhados primers para os oito loci e usadas dezassete estirpes de H. pylori e cento e sessenta e nove estirpes de Campylobacter para verificar se essa observação era comum entre as diferentes estirpes. Obteve-se amplificação em todos os loci testados mas observaram-se grandes diferenças entre eles, após digestão com HindIII. Pôde também observar-se que nalguns dos loci testados não se obteve amplificação. Todos os produtos de PCR cujo perfil foi diferente, quer de estirpes de H. pylori, quer de estirpes de Campylobacter, foram clonados em pUC19 e transformados em Escherichia coli DH10B, mas apenas sete dos produtos de Campylobacter codificaram para uma enzima de restrição activa. É possível que em H. pylori a maioria destes genes putativos esteja inactivo, não só porque nos genomas sequenciados existem várias ORF com frameshifts, mas também porque podem ter ocorrido movimentos de sequências de DNA entre domínios situados em posições diferentes, no interior de um gene. No futuro, a sequenciação dos clones obtidos poderá permitir perceber se essa é de facto a razão para a falta de actividade observada.
Autores principais:	Alves, Pedro Luís de Almeida, 1988-
Assunto:	Clonagem Sistema enzimático Bactérias Expressão génica Biologia molecular Teses de mestrado - 2011
Ano:	2011
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Os sistemas de restrição e modificação (RM) são sistemas enzimáticos não vitais, de complexidade variável, ubiquitários em Bacteria e Archaea. Actualmente considera-se que existam quatro grandes tipos e vários subtipos. Alguns dos géneros que pertencem à ordem Campylobacterales, nomeadamente Helicobacter e Campylobacter, têm uma característica pouco frequente, a presença de um elevado número de sistemas RM putativos no seu genoma. Analisaram-se os trinta e um genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie H. pylori e os nove genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie C. jejuni, anotados na REBASE (restriction enzyme database), e verificou-se que os sistemas RM não se encontram distribuídos ao acaso pelo genoma, localizando-se em loci bem definidos. A análise focou-se nos sistemas RM do tipo IIG e tendo as estirpes H. pylori 26695 e C. jejuni RM1221 como modelo, encontraram-se quatro loci em cada uma delas. Foram desenhados primers para os oito loci e usadas dezassete estirpes de H. pylori e cento e sessenta e nove estirpes de Campylobacter para verificar se essa observação era comum entre as diferentes estirpes. Obteve-se amplificação em todos os loci testados mas observaram-se grandes diferenças entre eles, após digestão com HindIII. Pôde também observar-se que nalguns dos loci testados não se obteve amplificação. Todos os produtos de PCR cujo perfil foi diferente, quer de estirpes de H. pylori, quer de estirpes de Campylobacter, foram clonados em pUC19 e transformados em Escherichia coli DH10B, mas apenas sete dos produtos de Campylobacter codificaram para uma enzima de restrição activa. É possível que em H. pylori a maioria destes genes putativos esteja inactivo, não só porque nos genomas sequenciados existem várias ORF com frameshifts, mas também porque podem ter ocorrido movimentos de sequências de DNA entre domínios situados em posições diferentes, no interior de um gene. No futuro, a sequenciação dos clones obtidos poderá permitir perceber se essa é de facto a razão para a falta de actividade observada.