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Organização da fracção repetitiva nos genomas de Cricetus cricetus, Peromyscus eremicus (Família Cricetidae) e Praomys tullbergi (Família Muridae). Considerações sobre a evolução do cromossoma X

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O aumento do nosso conhecimento sobre a natureza molecular da heterocromatina constitutiva, permite defini-la como um importante componente genómico, com funções ao nível da estrutura e regulação do genoma (Dimitri et al. 2004), para além de se considerar ainda o seu envolvimento na evolução de cariótipos. É actualmente aceite que a sua presença pode facilitar a ocorrência de rearranjos cromossómicos, considerando-se mesmo as regiões ricas nestas sequências de DNA como “hotspots” de reorganização cromossómica (Yunis e Yasmineh 1971, Peacock et al. 1982, John 1988, Chaves et al. 2004). No presente trabalho caracterizou-se detalhadamente a heterocromatina constitutiva dos cromossomas de três espécies de roedores, Cricetus cricetus, Peromyscus eremicus (Família Cricetidae), e Praomys tullbergi (Família Muridae), recorrendo-se à metodologia de restrição in situ (com um painel de sete enzimas de restrição) e bandeamento-C sequencial. Este trabalho permitiu detectar uma elevada heterogeneidade molecular nas sequências de heterocromatina constitutiva dos três genomas, provando ser uma ferramenta útil no estudo destas sequências. A comparação geral da quantidade, distribuição e natureza molecular da heterocromatina constitutiva das três espécies em análise, sugere a ocorrência de diferentes percursos evolutivos envolvidos na origem destes cariótipos. Na espécie C. cricetus, que apresenta um cariótipo quase totalmente meta/submetacêntrico, a heterocromatina constitutiva parece estar preferencialmente localizada em regiões (peri)centroméricas, apresentando a maioria dos autossomas dois blocos de heterocromatina constitutiva, o que sugere a ocorrência de, pelo menos, translocações Robertsonianas durante a evolução deste cariótipo. A espécie P. eremicus, com um cariótipo constituído apenas por cromossomas submetacêntricos, apresenta também grandes quantidades de heterocromatina constitutiva essencialmente localizada nas regiões (peri)centroméricas, sendo inclusivamente o braço curto da maioria dos cromossomas completamente heterocromático. A espécie P. tullbergi, com um complemento autossómico acrocêntrico, é das três espécies estudadas aquela cujos cromossomas exibem menos heterocromatina constitutiva centromérica. Em alguns cromossomas, a heterocromatina intersticial é quase tão abundante como a centromérica, contrariamente ao observado para a maioria dos cromossomas das outras duas espécies analisadas. Esta diferente distribuição e o elevado número de subclasses de heterocromatina constitutiva identificado nos cromossomas de P. tullbergi (52 subclasses), sugere que este cariótipo é o mais derivativo dos analisados neste trabalho, tendo sido originado pela ocorrência de um elevado número de complexos rearranjos cromossómicos. A elevada heterogeneidade das sequências de heterocromatina constitutiva identificada nos três genomas analisados, sugere a coexistência de diferentes famílias de DNA satélite, ou variantes destas famílias nestes genomas. A análise in silico das sequências LINE-1 (“Long Interspersed Elements-1”) permitiu estabelecer relações filogenéticas entre espécies, já que são caracteres não homoplásicos (Verneau et al. 1998, Waters et al. 2007). O alinhamento das sequências LINE-1 de C. cricetus, P. eremicus, P. tullbergi (isoladas pela primeira vez neste trabalho), M. musculus, R. norvegicus e de 10 espécies pertencentes à família Cricetidae, disponíveis na base de dados “NCBI Nucleotide”, demonstrou que todas as sequências correspondem a uma determinada região da ORFII da sequência LINE-1 das espécies índex M. musculus e R. norvegicus. Sugere-se assim que esta região da sequência está conservada nas várias espécies de roedores, observando-se valores de similaridade entre sequências acima dos 75%. O alinhamento de todas as sequências permitiu construir um dendograma que relaciona filogeneticamente todas as espécies analisadas, comprovando-se uma maior proximidade filogenética entre os roedores pertencentes à mesma família O mapeamento físico das sequências LINE-1 de C. cricetus, P. eremicus e P. tullbergi, nos respectivos cromossomas, demonstrou que estas sequências se encontram “interspersed” ao longo de todos os cromossomas, não se verificando uma localização preferencial destas sequências no cromossoma X. Estes resultados não suportam a hipótese de Lyon (1998), que sugere o envolvimento dos sequências LINE-1 na inactivação do cromossoma X, ao observar uma localização preferencial destas sequências no cromossoma X do Homem e rato. Duas hipóteses podem ser formuladas para justificar os resultados obtidos. Pode ter ocorrido perda de sequências LINE-1 no cromossoma X das três espécies no decorrer da evolução, sendo que este acontecimento foi anteriormente sugerido para outras espécies de roedores (Casavant et al. 2000), embora neste último caso, a perda destas sequências seja relativa a todo o complemento cromossómico. Outro cenário possível é a existência de diferentes mecanismos de inactivação do cromossoma X (pelo menos nestes roedores) sem que haja participação das sequências LINE-1, e neste caso, o genoma não precisaria de conservar estas sequências maioritariamente localizadas no cromossoma X, observando-se alternativamente uma distribuição indiferenciada por todo o complemento cromossómico A realização de “Comparative Chromosome Painting”, com uma sonda representativa do cromossoma X de R. norvegicus (RNOX) em preparações cromossómicas das três espécies, revelou três segmentos sinténicos num dos braços do cromossoma X de C. cricetus, oito segmentos sinténicos no cromossoma X de P. eremicus e seis segmentos sinténicos no braço longo do cromossoma X de P. tullbergi. Esta análise revelou ainda a ocorrência de uma inversão pericêntrica durante a evolução do cromossoma X de P. eremicus. A caracterização da heterocromatina constitutiva realizada durante este trabalho, revelou a existência de bandas-C a flanquear alguns segmentos sinténicos discriminados pelo “paint” RNOX no cromossoma X das três espécies analisadas. Estes resultados parecem assim sugerir a participação das sequências de heterocromatina na ocorrência dos rearranjos cromossómicos, que originaram estes cromossomas, evidenciada pela presença de sequências repetitivas nas regiões de “breakpoints” evolutivos. Ainda no âmbito deste trabalho, realizou-se uma análise in silico entre a distribuição cromossómica de sequências repetitivas em tandem e a localização de regiões de “breakpoints” evolutivos no cromossoma X da espécie índex M. musculus. Nesta análise recorreu-se às sintenias entre cromossomas do M. musculus, R. norvegicus e H. sapiens, para a identificação de regiões de “breakpoints” evolutivos no cromossoma X de M. musculus, e a ferramentas bioinformáticas que permitiram a avaliação da densidade de sequências repetitivas em tandem neste cromossoma. Resultados preliminares desta análise demonstram que as regiões que apresentam maior densidade de sequências repetitivas em tandem, correspondem de facto, a regiões de “breakpoints” evolutivos, o que vem comprovar o importante papel destas sequências na reorganização da arquitectura dos genomas ao longo da evolução. Quando se compararam os cromossomas X de C. cricetus, P. eremicus e P. tullbergi, observaram-se diferenças ao nível da sua morfologia, e na quantidade, localização e natureza molecular da sua heterocromatina, sugerindo que se originaram através da ocorrência de rearranjos cromossómicos como inversões, transposições centroméricas, adições/eliminações de heterocromatina e translocações Robertsonianas, como é o caso do cromossoma X de C. cricetus, que apresenta dois blocos de heterocromatina constitutiva na região (peri)centromérica. O maior número de subclasses de heterocromatina constitutiva identificado no cromossoma X de P. tullbergi, comparativamente às diferentes espécies em análise, sugere que o cromossoma X desta espécie é o mais rearranjado. No entanto, a análise dos segmentos sinténicos no cromossoma X das três espécies de roedores, com a sonda de “painting” RNOX, sugere o cromossoma X de P. eremicus como sendo o mais rearranjado. Esta aparente discordância deve-se provavelmente às diferentes análises efectuadas, nomeadamente, identificação de subclasses de heterocromatina e de segmentos sinténicos entre cromossomas de diferentes espécies, sendo indispensável uma investigação mais detalhada, de modo a clarificar efectivamente os mecanismos subjacentes à evolução destes cromossomas Futuros trabalhos que visem o estudo e caracterização de sequências de heterocromatina constitutiva, nomeadamente sequências de DNA satélite, isoladas por exemplo, por microdissecção de regiões centroméricas de cromossomas, e a construção de mapas comparativos para diferentes espécies de roedores, irão certamente contribuir para um melhor entendimento dos processos evolutivos que moldaram estes genomas e das relações filogenéticas entre espécies.
Autores principais:	Teixeira, Ana Isabel do Paço
Assunto:	Genoma Biologia molecular Heterocromatina
Ano:	2007
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Idioma:	português
Origem:	Repositório da UTAD

Descrição
Resumo:	O aumento do nosso conhecimento sobre a natureza molecular da heterocromatina constitutiva, permite defini-la como um importante componente genómico, com funções ao nível da estrutura e regulação do genoma (Dimitri et al. 2004), para além de se considerar ainda o seu envolvimento na evolução de cariótipos. É actualmente aceite que a sua presença pode facilitar a ocorrência de rearranjos cromossómicos, considerando-se mesmo as regiões ricas nestas sequências de DNA como “hotspots” de reorganização cromossómica (Yunis e Yasmineh 1971, Peacock et al. 1982, John 1988, Chaves et al. 2004). No presente trabalho caracterizou-se detalhadamente a heterocromatina constitutiva dos cromossomas de três espécies de roedores, Cricetus cricetus, Peromyscus eremicus (Família Cricetidae), e Praomys tullbergi (Família Muridae), recorrendo-se à metodologia de restrição in situ (com um painel de sete enzimas de restrição) e bandeamento-C sequencial. Este trabalho permitiu detectar uma elevada heterogeneidade molecular nas sequências de heterocromatina constitutiva dos três genomas, provando ser uma ferramenta útil no estudo destas sequências. A comparação geral da quantidade, distribuição e natureza molecular da heterocromatina constitutiva das três espécies em análise, sugere a ocorrência de diferentes percursos evolutivos envolvidos na origem destes cariótipos. Na espécie C. cricetus, que apresenta um cariótipo quase totalmente meta/submetacêntrico, a heterocromatina constitutiva parece estar preferencialmente localizada em regiões (peri)centroméricas, apresentando a maioria dos autossomas dois blocos de heterocromatina constitutiva, o que sugere a ocorrência de, pelo menos, translocações Robertsonianas durante a evolução deste cariótipo. A espécie P. eremicus, com um cariótipo constituído apenas por cromossomas submetacêntricos, apresenta também grandes quantidades de heterocromatina constitutiva essencialmente localizada nas regiões (peri)centroméricas, sendo inclusivamente o braço curto da maioria dos cromossomas completamente heterocromático. A espécie P. tullbergi, com um complemento autossómico acrocêntrico, é das três espécies estudadas aquela cujos cromossomas exibem menos heterocromatina constitutiva centromérica. Em alguns cromossomas, a heterocromatina intersticial é quase tão abundante como a centromérica, contrariamente ao observado para a maioria dos cromossomas das outras duas espécies analisadas. Esta diferente distribuição e o elevado número de subclasses de heterocromatina constitutiva identificado nos cromossomas de P. tullbergi (52 subclasses), sugere que este cariótipo é o mais derivativo dos analisados neste trabalho, tendo sido originado pela ocorrência de um elevado número de complexos rearranjos cromossómicos. A elevada heterogeneidade das sequências de heterocromatina constitutiva identificada nos três genomas analisados, sugere a coexistência de diferentes famílias de DNA satélite, ou variantes destas famílias nestes genomas. A análise in silico das sequências LINE-1 (“Long Interspersed Elements-1”) permitiu estabelecer relações filogenéticas entre espécies, já que são caracteres não homoplásicos (Verneau et al. 1998, Waters et al. 2007). O alinhamento das sequências LINE-1 de C. cricetus, P. eremicus, P. tullbergi (isoladas pela primeira vez neste trabalho), M. musculus, R. norvegicus e de 10 espécies pertencentes à família Cricetidae, disponíveis na base de dados “NCBI Nucleotide”, demonstrou que todas as sequências correspondem a uma determinada região da ORFII da sequência LINE-1 das espécies índex M. musculus e R. norvegicus. Sugere-se assim que esta região da sequência está conservada nas várias espécies de roedores, observando-se valores de similaridade entre sequências acima dos 75%. O alinhamento de todas as sequências permitiu construir um dendograma que relaciona filogeneticamente todas as espécies analisadas, comprovando-se uma maior proximidade filogenética entre os roedores pertencentes à mesma família O mapeamento físico das sequências LINE-1 de C. cricetus, P. eremicus e P. tullbergi, nos respectivos cromossomas, demonstrou que estas sequências se encontram “interspersed” ao longo de todos os cromossomas, não se verificando uma localização preferencial destas sequências no cromossoma X. Estes resultados não suportam a hipótese de Lyon (1998), que sugere o envolvimento dos sequências LINE-1 na inactivação do cromossoma X, ao observar uma localização preferencial destas sequências no cromossoma X do Homem e rato. Duas hipóteses podem ser formuladas para justificar os resultados obtidos. Pode ter ocorrido perda de sequências LINE-1 no cromossoma X das três espécies no decorrer da evolução, sendo que este acontecimento foi anteriormente sugerido para outras espécies de roedores (Casavant et al. 2000), embora neste último caso, a perda destas sequências seja relativa a todo o complemento cromossómico. Outro cenário possível é a existência de diferentes mecanismos de inactivação do cromossoma X (pelo menos nestes roedores) sem que haja participação das sequências LINE-1, e neste caso, o genoma não precisaria de conservar estas sequências maioritariamente localizadas no cromossoma X, observando-se alternativamente uma distribuição indiferenciada por todo o complemento cromossómico A realização de “Comparative Chromosome Painting”, com uma sonda representativa do cromossoma X de R. norvegicus (RNOX) em preparações cromossómicas das três espécies, revelou três segmentos sinténicos num dos braços do cromossoma X de C. cricetus, oito segmentos sinténicos no cromossoma X de P. eremicus e seis segmentos sinténicos no braço longo do cromossoma X de P. tullbergi. Esta análise revelou ainda a ocorrência de uma inversão pericêntrica durante a evolução do cromossoma X de P. eremicus. A caracterização da heterocromatina constitutiva realizada durante este trabalho, revelou a existência de bandas-C a flanquear alguns segmentos sinténicos discriminados pelo “paint” RNOX no cromossoma X das três espécies analisadas. Estes resultados parecem assim sugerir a participação das sequências de heterocromatina na ocorrência dos rearranjos cromossómicos, que originaram estes cromossomas, evidenciada pela presença de sequências repetitivas nas regiões de “breakpoints” evolutivos. Ainda no âmbito deste trabalho, realizou-se uma análise in silico entre a distribuição cromossómica de sequências repetitivas em tandem e a localização de regiões de “breakpoints” evolutivos no cromossoma X da espécie índex M. musculus. Nesta análise recorreu-se às sintenias entre cromossomas do M. musculus, R. norvegicus e H. sapiens, para a identificação de regiões de “breakpoints” evolutivos no cromossoma X de M. musculus, e a ferramentas bioinformáticas que permitiram a avaliação da densidade de sequências repetitivas em tandem neste cromossoma. Resultados preliminares desta análise demonstram que as regiões que apresentam maior densidade de sequências repetitivas em tandem, correspondem de facto, a regiões de “breakpoints” evolutivos, o que vem comprovar o importante papel destas sequências na reorganização da arquitectura dos genomas ao longo da evolução. Quando se compararam os cromossomas X de C. cricetus, P. eremicus e P. tullbergi, observaram-se diferenças ao nível da sua morfologia, e na quantidade, localização e natureza molecular da sua heterocromatina, sugerindo que se originaram através da ocorrência de rearranjos cromossómicos como inversões, transposições centroméricas, adições/eliminações de heterocromatina e translocações Robertsonianas, como é o caso do cromossoma X de C. cricetus, que apresenta dois blocos de heterocromatina constitutiva na região (peri)centromérica. O maior número de subclasses de heterocromatina constitutiva identificado no cromossoma X de P. tullbergi, comparativamente às diferentes espécies em análise, sugere que o cromossoma X desta espécie é o mais rearranjado. No entanto, a análise dos segmentos sinténicos no cromossoma X das três espécies de roedores, com a sonda de “painting” RNOX, sugere o cromossoma X de P. eremicus como sendo o mais rearranjado. Esta aparente discordância deve-se provavelmente às diferentes análises efectuadas, nomeadamente, identificação de subclasses de heterocromatina e de segmentos sinténicos entre cromossomas de diferentes espécies, sendo indispensável uma investigação mais detalhada, de modo a clarificar efectivamente os mecanismos subjacentes à evolução destes cromossomas Futuros trabalhos que visem o estudo e caracterização de sequências de heterocromatina constitutiva, nomeadamente sequências de DNA satélite, isoladas por exemplo, por microdissecção de regiões centroméricas de cromossomas, e a construção de mapas comparativos para diferentes espécies de roedores, irão certamente contribuir para um melhor entendimento dos processos evolutivos que moldaram estes genomas e das relações filogenéticas entre espécies.