Publicação

Development, physico-chemical and toxicological characterisation of solid lipid nanoparticles for application in breast cancer therapy

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As nanopartículas de lípidos sólidos (SLN, do inglês “solid lipid nanoparticles”) são transportadores coloidais de fármacos, constituídos por uma matriz de lípidos sólidos à temperatura corporal e à temperatura ambiente, estabilizados por agentes tensioactivos apropriados. No âmbito da presente tese, estes sistemas foram desenvolvidos com objectivo de administração de fármacos pouco solúveis em água, e para facilitar a administração direccionada a células de cancro. O objectivo deste trabalho consistiu em explorar o potencial das SLN no tratamento da invasão celular de cancro de mama, nomeadamente das células HER2/neu positivas. Foram desenvolvida partículas cuja composição consistiu no Imwitor 900K ou Compritol 888 ATO (como lípidos sólidos), no cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) como lípido catiónico/tensioactivo e no Lutrol F68 ou Miranol C32 Ultra como agente tensioactivo. Como método de produção, foi utilizada a homogenização a alta pressão ou a alta velocidade, seguindo-se a optimização das respectivas formulações, as quais foram utilizadas para os estudos posteriores. As SLN foram caracterizadas em termos de distribuição de tamanho médio das partículas, cristalinidade de matriz lipídica sólida e estabilidade durante armazenamento. Foram obtidas SLN com tamanho médio das partículas entre 115 nm e 334 nm e d0.90 inferior a 1 μm. O estado sólido das mesmas foi confirmado por calorimetria diferencial de varrimento e por difracção de raios X. Todas as formulações apresentaram estabilidade adequada ao longo de 5 semanas, quer à temperatura ambiente, quer a 4 °C. Apesar da liofilização com o crioprotector trealose, a estabilidade das SLN não liofilizadas revelou-se bastante superior. A formulação designada como cSLN-C manteve-se estável durante um período mínimo de 12 semanas. As SLN são, em geral, consideradas como transportadores coloidais com baixa toxicidade. Mesmo assim, o efeito das SLN per si tem importância na interpretação da interacção de formulações que contém um fármaco ou um anticorpo com as células. As SLN desenvolvidas neste trabalho não apresentaram toxicidade na concentração de 0,01 mg/ml. Utilizando a concentração de 0,1 mg/ml a viabilidade celular diminuiu dependendo da linha celular utilizada e tempo de exposição. A dose 1,0 mg/ml foi tóxica nas linhas celulares seleccionadas para este trabalho. Dentro destas, MCF-7 (carcinoma de mama, receptor de estrogénio positivo, HER2-neu negativo) foram as mais susceptíveis aos danos causados pelas SLN, as BT-474 (carcinoma mamário, HER2-neu positivo), HepG2 (hepatocarcinoma) e Caco-2 (cólon adenocarcinoma) foram menos susceptíveis em ordem decrescente. A toxicidade das SLN foi causada por disrupção de integridade das membranas celulares. Danos em ácido deoxiribonucléico (ADN) foram detectados por ensaio cometa. Foram reportados poucos danos – quando comparado com controlo sem tratamento (não significativo nas concentrações não tóxicas). Também foram detectados danos em purinas, que não causaram quebras de ADN. Alguns sinais de stress oxidativo foram detectados em células HepG2: a fluorescência de diacetato de diclorofluoresceina (DCFDA) encontrou-se aumentada relativamente aos controlos sem tratamento e aos positivos, verificou-se um aumento da actividade da enzima superóxido dismutase e uma diminuição da actividade de glutationa reductase. Apesar destes sinais de existência de stress oxidativo, os lípidos membranares não foram afectados (determinação como substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS). Estes resultados estão em concordância com poucos danos detectados em ADN (relativamente ao controlo sem tratamento). Os danos causados por stress oxidativo podem ocorrer em células com capacidade antioxidante inferior à das células HepG2. A capacidade de indução de stress oxidativo pode, hipoteticamente, ser vantajosa em veiculação de fármacos quimioterapêuticos, cujo mecanismo de acção exige existência de radicais livres, e pode, parcialmente, contribuir para a melhoria de eficácia destes medicamentos, quando veiculadas em SLN in vitro e in vivo. A Curcumina foi seleccionada como fármaco-modelo com potencial actividade antineoplásica. A baixa solubilidade aquosa, instabilidade em pH alcalino e fotossensibilidade são propriedades que fazem da curcumina um fármaco ideal para a encapsulação em SLN. Contudo, a solubilidade em vários lípidos foi igual ou inferior a 1 %. A baixa solubilidade em lípidos influenciou a capacidade de carga. Em combinação com as limitações atribuídas à toxicidade das SLN, apenas pode ser administrada 10 μg/ml (27 μM) no máximo, uma dose que é insuficiente para observar os efeitos anticancerígenos da curcumina. Um anticorpo anti- HER2/neu foi colocado na superfície das SLN utilizando a interacção streptavidina-biotina. O efeito de complexo anticorpo-SLN foi governado pela toxicidade das próprias SLN. A conjugação com o anticorpo melhorou significativamente a internalização de complexos nas células de cancro mamário. O efeito foi mais marcado em células BT474, HER2/neu positivas. O tratamento com complexo SLN-anticorpo causou uma diminuição de viabilidade celular das linhas de cancro de mama superior ao efeito das partículas isoladas ou do anticorpo isolado.
Autores principais:	Doktorovová, Slavomíra
Assunto:	Nanopartículas Curcumina Terapia génica Neoplasias mamárias Citotoxicidade imunológica Genotoxicidade
Ano:	2013
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da UTAD

Descrição
Resumo:	As nanopartículas de lípidos sólidos (SLN, do inglês “solid lipid nanoparticles”) são transportadores coloidais de fármacos, constituídos por uma matriz de lípidos sólidos à temperatura corporal e à temperatura ambiente, estabilizados por agentes tensioactivos apropriados. No âmbito da presente tese, estes sistemas foram desenvolvidos com objectivo de administração de fármacos pouco solúveis em água, e para facilitar a administração direccionada a células de cancro. O objectivo deste trabalho consistiu em explorar o potencial das SLN no tratamento da invasão celular de cancro de mama, nomeadamente das células HER2/neu positivas. Foram desenvolvida partículas cuja composição consistiu no Imwitor 900K ou Compritol 888 ATO (como lípidos sólidos), no cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) como lípido catiónico/tensioactivo e no Lutrol F68 ou Miranol C32 Ultra como agente tensioactivo. Como método de produção, foi utilizada a homogenização a alta pressão ou a alta velocidade, seguindo-se a optimização das respectivas formulações, as quais foram utilizadas para os estudos posteriores. As SLN foram caracterizadas em termos de distribuição de tamanho médio das partículas, cristalinidade de matriz lipídica sólida e estabilidade durante armazenamento. Foram obtidas SLN com tamanho médio das partículas entre 115 nm e 334 nm e d0.90 inferior a 1 μm. O estado sólido das mesmas foi confirmado por calorimetria diferencial de varrimento e por difracção de raios X. Todas as formulações apresentaram estabilidade adequada ao longo de 5 semanas, quer à temperatura ambiente, quer a 4 °C. Apesar da liofilização com o crioprotector trealose, a estabilidade das SLN não liofilizadas revelou-se bastante superior. A formulação designada como cSLN-C manteve-se estável durante um período mínimo de 12 semanas. As SLN são, em geral, consideradas como transportadores coloidais com baixa toxicidade. Mesmo assim, o efeito das SLN per si tem importância na interpretação da interacção de formulações que contém um fármaco ou um anticorpo com as células. As SLN desenvolvidas neste trabalho não apresentaram toxicidade na concentração de 0,01 mg/ml. Utilizando a concentração de 0,1 mg/ml a viabilidade celular diminuiu dependendo da linha celular utilizada e tempo de exposição. A dose 1,0 mg/ml foi tóxica nas linhas celulares seleccionadas para este trabalho. Dentro destas, MCF-7 (carcinoma de mama, receptor de estrogénio positivo, HER2-neu negativo) foram as mais susceptíveis aos danos causados pelas SLN, as BT-474 (carcinoma mamário, HER2-neu positivo), HepG2 (hepatocarcinoma) e Caco-2 (cólon adenocarcinoma) foram menos susceptíveis em ordem decrescente. A toxicidade das SLN foi causada por disrupção de integridade das membranas celulares. Danos em ácido deoxiribonucléico (ADN) foram detectados por ensaio cometa. Foram reportados poucos danos – quando comparado com controlo sem tratamento (não significativo nas concentrações não tóxicas). Também foram detectados danos em purinas, que não causaram quebras de ADN. Alguns sinais de stress oxidativo foram detectados em células HepG2: a fluorescência de diacetato de diclorofluoresceina (DCFDA) encontrou-se aumentada relativamente aos controlos sem tratamento e aos positivos, verificou-se um aumento da actividade da enzima superóxido dismutase e uma diminuição da actividade de glutationa reductase. Apesar destes sinais de existência de stress oxidativo, os lípidos membranares não foram afectados (determinação como substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS). Estes resultados estão em concordância com poucos danos detectados em ADN (relativamente ao controlo sem tratamento). Os danos causados por stress oxidativo podem ocorrer em células com capacidade antioxidante inferior à das células HepG2. A capacidade de indução de stress oxidativo pode, hipoteticamente, ser vantajosa em veiculação de fármacos quimioterapêuticos, cujo mecanismo de acção exige existência de radicais livres, e pode, parcialmente, contribuir para a melhoria de eficácia destes medicamentos, quando veiculadas em SLN in vitro e in vivo. A Curcumina foi seleccionada como fármaco-modelo com potencial actividade antineoplásica. A baixa solubilidade aquosa, instabilidade em pH alcalino e fotossensibilidade são propriedades que fazem da curcumina um fármaco ideal para a encapsulação em SLN. Contudo, a solubilidade em vários lípidos foi igual ou inferior a 1 %. A baixa solubilidade em lípidos influenciou a capacidade de carga. Em combinação com as limitações atribuídas à toxicidade das SLN, apenas pode ser administrada 10 μg/ml (27 μM) no máximo, uma dose que é insuficiente para observar os efeitos anticancerígenos da curcumina. Um anticorpo anti- HER2/neu foi colocado na superfície das SLN utilizando a interacção streptavidina-biotina. O efeito de complexo anticorpo-SLN foi governado pela toxicidade das próprias SLN. A conjugação com o anticorpo melhorou significativamente a internalização de complexos nas células de cancro mamário. O efeito foi mais marcado em células BT474, HER2/neu positivas. O tratamento com complexo SLN-anticorpo causou uma diminuição de viabilidade celular das linhas de cancro de mama superior ao efeito das partículas isoladas ou do anticorpo isolado.