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Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) and rearing environment. Importance in the prevention of fish diseases and public health

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A aquicultura é um dos sectores alimentares que tem crescido mais rapidamente em todo o mundo. Sendo uma atividade económica importante em muitos países contribuiu para o aumento da procura de alimentos de origem aquática. A utilização de bactérias ácido-lácticas (LAB) como probióticos constitui uma alternativa aos antibióticos e à vacinação no controlo das doenças dos peixes de aquicultura, incluindo a lactococose causada por Lactococcus garvieae. No Capítulo 1, a microbiota cultivável total (TM) e as LAB de truta arco-íris e do seu ambiente aquícola, em diferentes estados do ciclo de vida, foram isoladas e identificadas taxonomicamente. Enterobacteriaceae e Aeromonadaceae foram prevalentes na TM, enquanto o género Lactococcus foi a LAB predominante. De um total de 1620 LAB selecionadas aleatoriamente, 1159 isolados (71,5%) apresentaram atividade antimicrobiana contra os principais patógenos de peixes, incluindo 248 isolados (21,4%) que apresentaram atividade antimicrobiana contra, pelo menos, quatro patógenos de peixes. A identificação taxonómica revelou que Lactococcus lactis foi a espécie mais comum (164 isolados, 66,1%). A inocuidade, a relação genética e a actividade bacteriocinogénica de 75 estirpes de Lc. lactis com potencial probiótico foram avaliadas ao longo do Capítulo 2. Adicionalmente, a bacteriocina mais ativa contra a lactococose foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Dezassete estirpes (22%) produziram, pelo menos, uma amina biogénica, e 30 estirpes (40%) foram resistentes contra, pelo menos, um antibiótico. Os genes tet(K), tet(O) e tet(T) foram detetados pela primeira vez em Lc. lactis. A desconjugação dos sais biliares, produção de gelatinase e hemolisina tal como a degradação da mucina não foram observados. ERIC-PCR permitiu agrupar os lactococcos em três grupos altamente divergentes (31,0% de similaridade). Nove estirpes (12%) foram identificadas como produtoras de bacteriocinas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por Lc. lactis subsp. cremoris WA2-67, foi possível identificar esta bacteriocina como nisina Z (nisZ). Trinta e quatro lactococos supostamente inócuos (45,3%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67. No Capítulo 3 foram estudadas a inocuidade, a relação genética e a atividade bacteriocinogénica de oito estirpes de Pediococcus acidilactici isoladas da ração e de larvas de truta arco-íris. Além disso, a bacteriocina produzida pela estirpe mais ativa para ser utilizada como probiótico na aquicultura foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Nenhum dos pediococos foi resistente aos antibióticos, produziu hemolisina ou gelatinase, degradou a mucina gástrica ou desconjugou os sais biliares, ainda que apenas quatro estirpes produziram tiramina ou putrescina. ERIC-PCR permitiu agrupar os pediococos em dois grupos bem definidos (68,0% de similaridade). Seis estirpes (75%) foram identificadas como bacteriocinogénicas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por P. acidilactici L-14 foi possível identificar esta bacteriocina como pediocina PA-1. Quatro pediococos supostamente inócuos (50%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica P. acidilactici L-14. No decorrer do Capítulo 4, estudou-se a inocuidade e atividade antimicrobiana contra patógenos de 64 enterococos identificados taxonomicamente isolados de truta arco-íris, ração e ambiente aquícola. Enterococcus faecium e Enterococcus hirae foram as espécies mais comuns (42,2 e 35,9%, respetivamente). Quarenta e oito estirpes (75%) foram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antibiótico. Deste conjunto, 25 estirpes (39,1%), continham, pelo menos, um gene de resistência a antibióticos [erm(B), tet(M), tet(S), tet(K), tet(L), tet(T), vanC2 e aad(E)]. Detetou-se uma estirpe gelatinase positiva, e não se observou a produção de hemolisina, desconjugação de sais biliares e degradação de mucina. Vários genes de virulência foram detetados, incluindo gelE (46,9%), efaAfs (17,2%), agg (1,6%), e hyl (1,6%). Quarenta e oito estirpes inibiram o crescimento de, pelo menos, um dos patógenos de peixes testados, incluindo 21 (43,8%) estirpes que continham, no mínimo, um gene que codifica bacteriocina (entP, entL50A and entL50B, hirJM79, entSE-K4, entQ and entA). De um total de 17 enterococos (26,6%) considerados como supostamente inócuos, seis estirpes continham, pelo menos, um gene que codifica bacteriocina. As propriedades probióticas in vitro de três estirpes Lc. cremoris bacteriocinogénicas, a capacidade in vivo de Lc. cremoris WA2-67 para proteger a truta arco-íris contra a lactococose e o papel da produção de NisZ como um mecanismo anti-infeccioso foram analisadas no Capítulo 5. As três estipes de Lc. cremoris mostraram capacidade para sobreviver em água doce, meio ácido e bílis, e exibiram diferente hidrofobicidade da superfície celular (37,93-58,52%). A estirpe selvagem Lc. cremoris WA2-67 e o seu mutante não-bacteriocinogénico Lc. cremoris WA2-67 ΔnisZ foram administrados oralmente à truta arco-íris durante 21 dias e, posteriormente, os peixes foram infetados com Lc. garvieae pelo método de coabitação. A mortalidade observada nos peixes alimentados com a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67 (20%) foi significativamente (p <0,01) inferior à observada nos peixes tratados com a estirpe mutante (50%) e no grupo controlo (72,5%). Neste trabalho demonstrou-se que as LAB isoladas diretamente do hospedeiro, ativas contra patógenos de peixes, englobam potenciais candidatos a probióticos. Os resultados obtidos através da avaliação biotecnológica sugerem que a estirpe Lc. cremoris WA2-67 produtora de NisZ poderia ser utilizada na aquicultura para evitar a lactococose na truta arcoíris.
Autores principais:	Araújo, Carlos Alexandre Dias
Assunto:	Aquicultura Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris) Probióticos Bactérias ácido-lácticas Bacteriocina Biotecnologia Peixe Combate às doenças
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da UTAD

Descrição
Resumo:	A aquicultura é um dos sectores alimentares que tem crescido mais rapidamente em todo o mundo. Sendo uma atividade económica importante em muitos países contribuiu para o aumento da procura de alimentos de origem aquática. A utilização de bactérias ácido-lácticas (LAB) como probióticos constitui uma alternativa aos antibióticos e à vacinação no controlo das doenças dos peixes de aquicultura, incluindo a lactococose causada por Lactococcus garvieae. No Capítulo 1, a microbiota cultivável total (TM) e as LAB de truta arco-íris e do seu ambiente aquícola, em diferentes estados do ciclo de vida, foram isoladas e identificadas taxonomicamente. Enterobacteriaceae e Aeromonadaceae foram prevalentes na TM, enquanto o género Lactococcus foi a LAB predominante. De um total de 1620 LAB selecionadas aleatoriamente, 1159 isolados (71,5%) apresentaram atividade antimicrobiana contra os principais patógenos de peixes, incluindo 248 isolados (21,4%) que apresentaram atividade antimicrobiana contra, pelo menos, quatro patógenos de peixes. A identificação taxonómica revelou que Lactococcus lactis foi a espécie mais comum (164 isolados, 66,1%). A inocuidade, a relação genética e a actividade bacteriocinogénica de 75 estirpes de Lc. lactis com potencial probiótico foram avaliadas ao longo do Capítulo 2. Adicionalmente, a bacteriocina mais ativa contra a lactococose foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Dezassete estirpes (22%) produziram, pelo menos, uma amina biogénica, e 30 estirpes (40%) foram resistentes contra, pelo menos, um antibiótico. Os genes tet(K), tet(O) e tet(T) foram detetados pela primeira vez em Lc. lactis. A desconjugação dos sais biliares, produção de gelatinase e hemolisina tal como a degradação da mucina não foram observados. ERIC-PCR permitiu agrupar os lactococcos em três grupos altamente divergentes (31,0% de similaridade). Nove estirpes (12%) foram identificadas como produtoras de bacteriocinas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por Lc. lactis subsp. cremoris WA2-67, foi possível identificar esta bacteriocina como nisina Z (nisZ). Trinta e quatro lactococos supostamente inócuos (45,3%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67. No Capítulo 3 foram estudadas a inocuidade, a relação genética e a atividade bacteriocinogénica de oito estirpes de Pediococcus acidilactici isoladas da ração e de larvas de truta arco-íris. Além disso, a bacteriocina produzida pela estirpe mais ativa para ser utilizada como probiótico na aquicultura foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Nenhum dos pediococos foi resistente aos antibióticos, produziu hemolisina ou gelatinase, degradou a mucina gástrica ou desconjugou os sais biliares, ainda que apenas quatro estirpes produziram tiramina ou putrescina. ERIC-PCR permitiu agrupar os pediococos em dois grupos bem definidos (68,0% de similaridade). Seis estirpes (75%) foram identificadas como bacteriocinogénicas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por P. acidilactici L-14 foi possível identificar esta bacteriocina como pediocina PA-1. Quatro pediococos supostamente inócuos (50%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica P. acidilactici L-14. No decorrer do Capítulo 4, estudou-se a inocuidade e atividade antimicrobiana contra patógenos de 64 enterococos identificados taxonomicamente isolados de truta arco-íris, ração e ambiente aquícola. Enterococcus faecium e Enterococcus hirae foram as espécies mais comuns (42,2 e 35,9%, respetivamente). Quarenta e oito estirpes (75%) foram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antibiótico. Deste conjunto, 25 estirpes (39,1%), continham, pelo menos, um gene de resistência a antibióticos [erm(B), tet(M), tet(S), tet(K), tet(L), tet(T), vanC2 e aad(E)]. Detetou-se uma estirpe gelatinase positiva, e não se observou a produção de hemolisina, desconjugação de sais biliares e degradação de mucina. Vários genes de virulência foram detetados, incluindo gelE (46,9%), efaAfs (17,2%), agg (1,6%), e hyl (1,6%). Quarenta e oito estirpes inibiram o crescimento de, pelo menos, um dos patógenos de peixes testados, incluindo 21 (43,8%) estirpes que continham, no mínimo, um gene que codifica bacteriocina (entP, entL50A and entL50B, hirJM79, entSE-K4, entQ and entA). De um total de 17 enterococos (26,6%) considerados como supostamente inócuos, seis estirpes continham, pelo menos, um gene que codifica bacteriocina. As propriedades probióticas in vitro de três estirpes Lc. cremoris bacteriocinogénicas, a capacidade in vivo de Lc. cremoris WA2-67 para proteger a truta arco-íris contra a lactococose e o papel da produção de NisZ como um mecanismo anti-infeccioso foram analisadas no Capítulo 5. As três estipes de Lc. cremoris mostraram capacidade para sobreviver em água doce, meio ácido e bílis, e exibiram diferente hidrofobicidade da superfície celular (37,93-58,52%). A estirpe selvagem Lc. cremoris WA2-67 e o seu mutante não-bacteriocinogénico Lc. cremoris WA2-67 ΔnisZ foram administrados oralmente à truta arco-íris durante 21 dias e, posteriormente, os peixes foram infetados com Lc. garvieae pelo método de coabitação. A mortalidade observada nos peixes alimentados com a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67 (20%) foi significativamente (p <0,01) inferior à observada nos peixes tratados com a estirpe mutante (50%) e no grupo controlo (72,5%). Neste trabalho demonstrou-se que as LAB isoladas diretamente do hospedeiro, ativas contra patógenos de peixes, englobam potenciais candidatos a probióticos. Os resultados obtidos através da avaliação biotecnológica sugerem que a estirpe Lc. cremoris WA2-67 produtora de NisZ poderia ser utilizada na aquicultura para evitar a lactococose na truta arcoíris.