Publicação
An «omic» approach to characterize antibiotic resistance of Salmonella spp.: impacts in food safety and public health
| Resumo: | A resistência aos antimicrobianos representa uma ameaça séria e actual à saúde pública mundial e estirpes multirresistentes de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Typhimurium e fagotipo DT104B com resistência adicional às quinolonas têm sido responsáveis por surtos globais e elevada mortalidade. Devido ao elevado impacto das infecções por Salmonella não tifóide e à vital importância dos antibióticos da classe das fluoroquinolonas, a resistência às fluoroquinolonas em Salmonella não tifóide é considerada uma situação de elevada preocupação a nível internacional. Apesar de ser do conhecimento geral que a resistência às fluoroquinolonas é multifactorial, ainda se desconhecem muitos dos elementos que contribuem para este fenótipo. A proteómica tem progredido significativamente no que respeita à caracterização de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, tendo contribuído amplamente para o conhecimento actual dos efeitos das redes metabólicas na antibiorresistência assim como na identificação de novos alvos. De modo a contribuir com novas perspectivas sobre os mecanismos de resistência envolvidos, três estirpes clínicas clonalmente relacionadas de Salmonella Typhimurium DT104B com fenótipos de resistência distintos, Se6, Se20 e Se6-M, foram exaustivamente estudadas através de diferentes abordagens proteómicas, complementadas com métodos genómicos e transcriptómicos. Numa análise preliminar, o proteoma total da estirpe Se20, que adquiriu resistência às quinolonas in vivo após tratamento do paciente com ciprofloxacina, tal como o proteoma total da estirpe de referência SL1344, foram determinados por 2-DE~MALDI-TOF MS. Um total de 178 e 202 spots proteicos (representando 143 e 166 produtos de genes específicos) foram identificados, respectivamente, nas estirpes Se20 e SL1344, fornecendo uma visão global da expressão proteica destas estirpes em condições normais de crescimento. Subsequentemente, com o intuito de detectar proteínas diferencialmente expressas relacionadas com mecanismos de resistência, foram realizadas várias análises subproteómicas comparativas, combinando identificação por 2-DE~LC-MS/MS e shotgun LC-MS/MS para análise do subproteoma intracelular e membranar, respectivamente. Numa primeira instância, a estirpe Se20, seleccionada in vivo, foi comparada à estirpe Se6-M, um mutante altamente resistente seleccionado in vitro a partir da estirpe parental da Se20 (Se6) por passagens sucessivas em concentrações crescentes de ciprofloxacina. Um total de 50 e 7 proteínas (32+2 mais abundantes em Se20 e 18+5 mais abundantes em Se6-M) foram identificadas nos subproteomas intracelular e membranar, respectivamente. Posteriormente, cada estirpe resistente, Se20 e Se6-M, foi comparada individualmente ao nível subproteómico com a estirpe parental, Se6, e também sob stress com ciprofloxacina. No total, foram identificadas 14 proteínas diferencialmente expressas ao comparar as estirpes Se6 e Se20 e 91 proteínas ao comparar a estirpe Se20 com Se20+CIP. Um total de 35 proteínas diferencialmente expressas foram identificadas na comparação das estirpes Se6 e Se6-M e 82 foram identificadas entre Se6-M e Se6-M+CIP. Em conjunto, ambas as condições de stress revelaram um total de 125 proteínas relacionadas com a resposta à ciprofloxacina, das quais apenas 45 são comuns a ambas as estirpes. Das restantes, 45 e 38 foram identificadas exclusivamente nas estirpes Se20 e Se6-M, respectivamente, salientando a importância de incluir tanto estirpes adaptadas em laboratório como estirpes adaptadas clinicamente neste tipo de abordagens comparativas. O papel das proteínas identificadas como determinantes de resistência é discutido nos contextos do influxo reduzido de antibióticos através da diminuição da expressão de porinas e de alterações na organização e integridade da membrana externa através de modificações de LPS, lipoproteínas ou peptidoglicano. Adicionalmente, é também discutido o papel de importadores ABC, de reguladores metabólicos e dos mecanismos bacterianos de resposta ao stress, quer como determinantes de resistência ou alvos para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O elevado número de proteínas identificadas neste estudo constitui informação valiosa sobre a expressão diferencial de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, fornecendo novas evidências sobre a natureza dos distúrbios fisiológicos causados pelo antibiótico. Tal pode conduzir à formulação de novas hipóteses no que respeita não só ao mecanismo de acção das fluoroquinolonas, mas também a proteínas-alvo secundárias implicadas em mecanismos adaptativos e compensatórios. Os resultados obtidos salientam ainda que o uso coordenado de técnicas proteómicas e bioinfomáticas de alto rendimento, complementadas com diferentes métodos genómicos e transcriptómicos, possibilitam uma melhor detecção dos múltiplos mecanismos envolvidos na aquisição de resistência. As vias envolvidas na aquisição de resistência, realçadas nas diversas abordagens realizadas neste estudo, podem ser úteis não só para prolongar o uso dos antibióticos actuais, como também para o desenvolvimento de novos antibióticos e estratégias alternativas para combater a emergência e disseminação de resistência no agente patogénico de origem alimentar de elevado impacto na saúde humana, Salmonella Typhimurium DT104B. |
|---|---|
| Autores principais: | Correia, Susana Apolinário |
| Assunto: | Resistência microbiana a medicamentos Antimicrobiano Salmonella Typhimurium Proteínas de bactérias Quinolonas Ciprofloxacina Proteoma |
| Ano: | 2017 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da UTAD |
| Resumo: | A resistência aos antimicrobianos representa uma ameaça séria e actual à saúde pública mundial e estirpes multirresistentes de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Typhimurium e fagotipo DT104B com resistência adicional às quinolonas têm sido responsáveis por surtos globais e elevada mortalidade. Devido ao elevado impacto das infecções por Salmonella não tifóide e à vital importância dos antibióticos da classe das fluoroquinolonas, a resistência às fluoroquinolonas em Salmonella não tifóide é considerada uma situação de elevada preocupação a nível internacional. Apesar de ser do conhecimento geral que a resistência às fluoroquinolonas é multifactorial, ainda se desconhecem muitos dos elementos que contribuem para este fenótipo. A proteómica tem progredido significativamente no que respeita à caracterização de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, tendo contribuído amplamente para o conhecimento actual dos efeitos das redes metabólicas na antibiorresistência assim como na identificação de novos alvos. De modo a contribuir com novas perspectivas sobre os mecanismos de resistência envolvidos, três estirpes clínicas clonalmente relacionadas de Salmonella Typhimurium DT104B com fenótipos de resistência distintos, Se6, Se20 e Se6-M, foram exaustivamente estudadas através de diferentes abordagens proteómicas, complementadas com métodos genómicos e transcriptómicos. Numa análise preliminar, o proteoma total da estirpe Se20, que adquiriu resistência às quinolonas in vivo após tratamento do paciente com ciprofloxacina, tal como o proteoma total da estirpe de referência SL1344, foram determinados por 2-DE~MALDI-TOF MS. Um total de 178 e 202 spots proteicos (representando 143 e 166 produtos de genes específicos) foram identificados, respectivamente, nas estirpes Se20 e SL1344, fornecendo uma visão global da expressão proteica destas estirpes em condições normais de crescimento. Subsequentemente, com o intuito de detectar proteínas diferencialmente expressas relacionadas com mecanismos de resistência, foram realizadas várias análises subproteómicas comparativas, combinando identificação por 2-DE~LC-MS/MS e shotgun LC-MS/MS para análise do subproteoma intracelular e membranar, respectivamente. Numa primeira instância, a estirpe Se20, seleccionada in vivo, foi comparada à estirpe Se6-M, um mutante altamente resistente seleccionado in vitro a partir da estirpe parental da Se20 (Se6) por passagens sucessivas em concentrações crescentes de ciprofloxacina. Um total de 50 e 7 proteínas (32+2 mais abundantes em Se20 e 18+5 mais abundantes em Se6-M) foram identificadas nos subproteomas intracelular e membranar, respectivamente. Posteriormente, cada estirpe resistente, Se20 e Se6-M, foi comparada individualmente ao nível subproteómico com a estirpe parental, Se6, e também sob stress com ciprofloxacina. No total, foram identificadas 14 proteínas diferencialmente expressas ao comparar as estirpes Se6 e Se20 e 91 proteínas ao comparar a estirpe Se20 com Se20+CIP. Um total de 35 proteínas diferencialmente expressas foram identificadas na comparação das estirpes Se6 e Se6-M e 82 foram identificadas entre Se6-M e Se6-M+CIP. Em conjunto, ambas as condições de stress revelaram um total de 125 proteínas relacionadas com a resposta à ciprofloxacina, das quais apenas 45 são comuns a ambas as estirpes. Das restantes, 45 e 38 foram identificadas exclusivamente nas estirpes Se20 e Se6-M, respectivamente, salientando a importância de incluir tanto estirpes adaptadas em laboratório como estirpes adaptadas clinicamente neste tipo de abordagens comparativas. O papel das proteínas identificadas como determinantes de resistência é discutido nos contextos do influxo reduzido de antibióticos através da diminuição da expressão de porinas e de alterações na organização e integridade da membrana externa através de modificações de LPS, lipoproteínas ou peptidoglicano. Adicionalmente, é também discutido o papel de importadores ABC, de reguladores metabólicos e dos mecanismos bacterianos de resposta ao stress, quer como determinantes de resistência ou alvos para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O elevado número de proteínas identificadas neste estudo constitui informação valiosa sobre a expressão diferencial de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, fornecendo novas evidências sobre a natureza dos distúrbios fisiológicos causados pelo antibiótico. Tal pode conduzir à formulação de novas hipóteses no que respeita não só ao mecanismo de acção das fluoroquinolonas, mas também a proteínas-alvo secundárias implicadas em mecanismos adaptativos e compensatórios. Os resultados obtidos salientam ainda que o uso coordenado de técnicas proteómicas e bioinfomáticas de alto rendimento, complementadas com diferentes métodos genómicos e transcriptómicos, possibilitam uma melhor detecção dos múltiplos mecanismos envolvidos na aquisição de resistência. As vias envolvidas na aquisição de resistência, realçadas nas diversas abordagens realizadas neste estudo, podem ser úteis não só para prolongar o uso dos antibióticos actuais, como também para o desenvolvimento de novos antibióticos e estratégias alternativas para combater a emergência e disseminação de resistência no agente patogénico de origem alimentar de elevado impacto na saúde humana, Salmonella Typhimurium DT104B. |
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